延安大学：《病理学 Pathology》课程教学资源（病理实验技术）免疫组织化学技术_免疫荧光技术

免疫荧光技术 免疫荧光细胞化学技术是根据抗原抗体反应的规律,把已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗原或抗 体,然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。免疫荧光细胞化学技术需要特殊的荧光显微镜才能观察 到,且标本不能长期保存,故在临床病理方面应用较少,但亦有其独特的优势,即具有的高度的特异性、敏感性、 快速性和某方面的准确性以及众多特殊荧光探针的使用,能够定量观察等,目前已经广泛地应用于许多硏究领域 如免疫学、微生物学、病理学和临床检验学等 (一)常用的抗体和蛋白质标记的荧光素 1.异硫氰酸荧光素( Fluoresein isothiocyanate,FITC)结晶粉末状,呈黄色、橙黄色或褐黄色,易溶于水 和乙醇等溶剂,室温下可保存两年以上,最大发射光谱为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光, 2.四甲基异硫氰酸罗达明( Tetramethy rhodamine isothiocyanate, TMRITC)结晶粉末状,呈紫红色,易溶 于水和乙醇等溶剂。最大发射光谱为620m,呈现橙红色荧光。 3.四乙基罗达明( Tetrame thy Rhodamine B200,RB200)结晶粉末状,呈褐红色,易溶于酒精和丙酮,但不 溶于水。最大发射光谱为596~600m,呈现橙红色荧光。 (二)常用的荧光标记法 1.直接法这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体,染色时将该抗 体直接滴在载玻片上进行孵育,使之直接与载玻片上的抗原结合,于荧光显微镜下观察检查,作出判断。 评价:该法简单易行、特异性高、快速方便,常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足 是只能检测相应的一种物质,敏感性较差,效果有时不理想,目前较少作为更多方面的检测。 2.间接法该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后,继用间接荧光抗体,与前面的抗原抗-体 复合物结合,形成抗原-抗体-荧光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。 评价:本法由于结合在抗原-抗体复合物上的荧光素抗体增多,发出的荧光亮度强,因而其敏感性强。目前本 法应用较广泛,只需制备一种属荧光抗体,即可适用于多种第一抗体的标记显示。存在问题:①制作好的切片不能 长期保存,影响各种资料的积累;②所作出的结论较主观;③有些经固定的石蜡切片不适合等 三)荧光显微镜标本制作要求 1.载玻片必须光洁,厚度均匀(0.8-1.2mm),无明显自发荧光 2.盖玻片光洁,厚度在0.17mm左右。 3.封固剂必须无自发荧光,无色透明,常用甘油和0.5mol/LPH9.0-9.5碳酸盐缓冲液的等量混合液作封固剂。 4.标本组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部未充分 激发。另外,细胞、组织重叠或杂质掩盖影响判断。 镜油一般暗视野荧光显微镜和油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,也可以用缓 冲甘油代替。液体石蜡也可用,但折光率较低,对图象质量略有影响 (四)荧光染色注意事项 1.染色反应最好在湿盒内进行,以免标本上的试剂干燥,造成非特异性染色。 2.染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜(PH7.4左右),因此,切片冲洗液及抗体稀释液均应注意酸碱度的 调整

免疫荧光技术 免疫荧光细胞化学技术是根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗 体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。免疫荧光细胞化学技术需要特殊的荧光显微镜才能观察 到，且标本不能长期保存，故在临床病理方面应用较少，但亦有其独特的优势，即具有的高度的特异性、敏感性、 快速性和某方面的准确性以及众多特殊荧光探针的使用，能够定量观察等，目前已经广泛地应用于许多研究领域， 如免疫学、微生物学、病理学和临床检验学等。   （一）常用的抗体和蛋白质标记的荧光素   1.异硫氰酸荧光素（Fluoresein isothiocyanate，FITC）结晶粉末状，呈黄色、橙黄色或褐黄色，易溶于水 和乙醇等溶剂，室温下可保存两年以上，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。   2.四甲基异硫氰酸罗达明（Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TMRITC） 结晶粉末状，呈紫红色，易溶 于水和乙醇等溶剂。最大发射光谱为620nm，呈现橙红色荧光。   3.四乙基罗达明（Tetramethylrhodamine B200，RB200） 结晶粉末状，呈褐红色，易溶于酒精和丙酮，但不 溶于水。最大发射光谱为596～600nm，呈现橙红色荧光。   （二）常用的荧光标记法   1.直接法 这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗 体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，于荧光显微镜下观察检查，作出判断。   评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足 是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。   2.间接法 该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗-体 复合物结合，形成抗原-抗体-荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。   评价：本法由于结合在抗原-抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。目前本 法应用较广泛，只需制备一种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。存在问题：①制作好的切片不能 长期保存，影响各种资料的积累；②所作出的结论较主观；③有些经固定的石蜡切片不适合等。   （三）荧光显微镜标本制作要求 1.载玻片必须光洁，厚度均匀（0.8-1.2mm），无明显自发荧光。   2.盖玻片光洁，厚度在0.17mm左右。   3.封固剂必须无自发荧光，无色透明，常用甘油和0.5mol/LPH9.0-9.5碳酸盐缓冲液的等量混合液作封固剂。 4.标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部未充分 激发。另外，细胞、组织重叠或杂质掩盖影响判断。   5.镜油 一般暗视野荧光显微镜和油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可以用缓 冲甘油代替。液体石蜡也可用，但折光率较低，对图象质量略有影响。   （四）荧光染色注意事项   1.染色反应最好在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥，造成非特异性染色。   2.染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜（PH7.4左右），因此，切片冲洗液及抗体稀释液均应注意酸碱度的 调整

3.组织细胞要求新鲜,因此冰冻切片是免疫荧光染色的首选方法,同时注意避免切片折叠或杂质过多,以免影 响荧光的观察。 4.切片经染色后,应及时观察并照相,不宜长期保存,以免褪色。切片在4℃冰箱内过夜,其荧光强度将减弱 约30% 5.抗体稀释度以获得最佳染色效果,背景非特异性染色最小为标准,因此对每一批抗体必须试验摸索,找出最 佳稀释浓度。若非特异性染色过强时,在染色反应前应先将荧光抗体离心,去除沉淀物后再使用 6.为防止抗体效果下降,所购抗体应及早试验,并应尽量减少抗体溶液的冻溶次数 (五)使用荧光显微镜注意事项 1.使用荧光显微镜,严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序 2.应在暗室中进行检査,防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜 3.检查时间以每次12h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3 5min后,荧光也明显减弱或褪色,激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象,所以最多不得超过2~3h 4.荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检査,以节省时间,保护光源。天热时,应加电扇散热降温,新换灯 泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 关闭汞灯至少在开启15-30分钟后,电源最好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效 (六)免疫荧光方法中的重要环节 1.冰冻切片制备建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织 定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重 2.组织切片固定切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要 及时固定和适当保存 3.血清封闭为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在第一抗体孵育前先用血清(与第二抗体来源一 致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min 4.第一抗体孵育条件在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。第一抗体抗孵育温度有几种: 4℃、室温、37℃,其中4℃效果最佳。孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37℃,1-2h,而4℃过夜和从冰 箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索 5.第二抗体孵育条件一般室温或37℃,30-60min,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还 要摸索浓度,切记要避光反应。但在免疫荧光中一般先把第二抗体浓度和孵育时间先定下,然后去摸索第一抗体浓 度和孵育时间。最后,荧光素标记的第二抗体随着保存时间的延长,可能会有大量的游离荧光素残留,需要注意配 制时小包装和并进行适当的离心 复染目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染 7.封片为了长期保存,一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法是 直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的 拐角先降低,直至接触到液体时为止:当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会 产生气泡。 切片清洗为了防止第一抗体、第二抗体等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间 和增多次数)尤为重要,一般在第一抗体孵育前的清洗是3min×3次,而第一抗体孵育后的清洗均为5min×5次。注

3.组织细胞要求新鲜，因此冰冻切片是免疫荧光染色的首选方法，同时注意避免切片折叠或杂质过多，以免影 响荧光的观察。   4.切片经染色后，应及时观察并照相，不宜长期保存，以免褪色。切片在4℃冰箱内过夜，其荧光强度将减弱 约30%。   5.抗体稀释度以获得最佳染色效果，背景非特异性染色最小为标准，因此对每一批抗体必须试验摸索，找出最 佳稀释浓度。若非特异性染色过强时，在染色反应前应先将荧光抗体离心，去除沉淀物后再使用   6.为防止抗体效果下降，所购抗体应及早试验，并应尽量减少抗体溶液的冻溶次数。   （五）使用荧光显微镜注意事项   1.使用荧光显微镜，严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序   2.应在暗室中进行检查，防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。   3.检查时间以每次1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3- 5min后，荧光也明显减弱或褪色，激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，所以最多不得超过2~3h。 4.荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯 泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 关闭汞灯至少在开启15-30分钟后，电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效 果。   （六）免疫荧光方法中的重要环节   1.冰冻切片制备 建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织 一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。   2.组织切片固定 切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要 及时固定和适当保存。   3.血清封闭 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在第一抗体孵育前先用血清（与第二抗体来源一 致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。   4.第一抗体孵育条件 在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。第一抗体抗孵育温度有几种： 4℃、室温、37℃，其中4℃效果最佳。孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃，1-2h，而4℃过夜和从冰 箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。   5.第二抗体孵育条件 一般室温或37℃，30-60min，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还 要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中一般先把第二抗体浓度和孵育时间先定下，然后去摸索第一抗体浓 度和孵育时间。最后，荧光素标记的第二抗体随着保存时间的延长，可能会有大量的游离荧光素残留，需要注意配 制时小包装和并进行适当的离心。   6.复染 目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。   7.封片 为了长期保存，一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是 直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的 拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会 产生气泡。   8.切片清洗 为了防止第一抗体 、第二抗体等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间 和增多次数）尤为重要，一般在第一抗体孵育前的清洗是3min×3次，而第一抗体孵育后的清洗均为5min×5次。注

意:①单独冲洗,防止交叉反应造成污染。②温柔浸洗,防止切片的脱落。③冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结 合的物质。④PBS的PH和离子强度的使用和要求。建议P在7.4-7.6浓度是0.0M。中性及弱硷性条件(PH7-8)有利 于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分 9.拍照最好立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度

意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温柔浸洗，防止切片的脱落。③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结 合的物质。④PBS的PH和离子强度的使用和要求。建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分 解。   9.拍照 最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度