延安大学：《病理学 Pathology》课程教学资源（病理实验技术）组织病理学技术_冰冻切片技术

冰冻切片技术 (一)冰冻切片技术的应用 冷冻切片是利用低温冷冻组织使其变硬,以代替石蜡包埋,来进行组织制片的方法。可以在几秒或几分钟内将 组织冷冻好,无需固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等繁杂的组织处理程序,冷冻切片不仅能保持组织细胞形态结构 的完整,是外科手术中快速病理诊断的常用技术,而且组织细胞内的抗原、抗体、酶的活性不受损害,免疫组织化 学、酶组织化学,免疫荧光标记等均需新鲜组织在冷冻切片上进行。因此冷冻切片技术已成为医学研究中的一种 重要手段。随着新一代冷冻切片机的出现,冷冻切片的应用更加普及,是一种较理想的快速简便制片方法。冰冻切 片技术主要应用于:①确定病变性质。如某一送检标本是肿瘤性还是非肿瘤性病变;如果是肿瘤性病变,是良性肿 瘤、交界性肿瘤还是恶性肿瘤。②确定恶性肿瘤的扩散情况。如前哨淋巴结或肿瘤周围淋巴结是否有转移,肿瘤是 否浸润到邻近组织等。③确定手术切缘是否残留癌组织,以决定是否需要扩大手术范围。④鉴定切除标本的组织类 型。⑤证实组织内的脂类物质。⑥免疫荧光组织化学研究。如肾穿刺标本的IgA、IgG、IsM、C3、C4、C2、抗体轻 链等免疫荧光标记。⑦免疫酶组织化学和亲合免疫细胞化学研究。如肿瘤细胞内的某些抗原的保存,癌基因活性的 检测等常需要冷冻切片。⑧酶组织化学硏究。如显示碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖-δ-磷酸酶、非特异性酯酶 等需要冷冻切片来保存酶的活性。 (二)低温恒冷冷冻切片的操作技术 1.操作步骤 (1)工作前h应接通电源,打开开关,开机预冷,调节好冷冻室内温度,打开切片机运转旋钮,使之能前后调 节,当达到预选的冷冻室温度时方可工作 (2)送检组织或实验动物组织,不加任何固定剂,必要时用生理盐水洗去血污,取材厚度不超过0.3cm (3)将湿滤纸贴于预冷冻的标本盘垫上冻结,然后将组织块粘贴在标本盘垫上,加上0CT包埋剂,用冷锤轻压其 上,速冻1-2min,使0CT固化呈乳白色 (4)旋紧组织移动标本夹孔上的螺旋钮 (5)电脑控制的冷冻切片机可开动切片程序(手摇冷冻切片机,则右手摇动切片机,左手移动粗调节按钮,先 削平组织块) (6)调整好防卷板和切片厚度微调,开始收集及附贴切片。(附贴方法根据冷冻切片的目的,可选用以下方 法:①将切片贴在载玻片或盖玻片(室温)上,稍待片刻,即浸于固定剂中固定或浸于冷的保护剂中。②将切片贴 在载玻片或盖玻片上干燥后固定,染色,观察(酶组织化学)。③将切片移入温或冷的孵育液中(酶组织化学)显 示、观察。④将切片贴在温或冷的其他试剂中(蛋白质和无机物的组织化学)。切片厚度一般为5-6μm,切出的片 子用载玻片贴附后立即放入A-F液(无水乙醇和甲醛液各半)中固定,固定时间为20~30s。 (7水洗1-2mino (8) Harris苏木素溶液lmin 9)水洗1-2min (10)1%盐酸乙醇分化数秒,流水冲洗。 (11)温水蓝化(或1%氨水返蓝30s)。 (12)1%伊红染色液5-10s (13)梯度乙醇快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固

冰冻切片技术 （一）冰冻切片技术的应用 冷冻切片是利用低温冷冻组织使其变硬，以代替石蜡包埋，来进行组织制片的方法。可以在几秒或几分钟内将 组织冷冻好，无需固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等繁杂的组织处理程序，冷冻切片不仅能保持组织细胞形态结构 的完整，是外科手术中快速病理诊断的常用技术，而且组织细胞内的抗原、抗体、酶的活性不受损害，免疫组织化 学、酶组织化学，免疫 荧光标记等均需新鲜组织在冷冻切片上进行。因此冷冻切片技术已成为医学研究中的一种 重要手段。随着新一代冷冻切片机的出现，冷冻切片的应用更加普及，是一种较理想的快速简便制片方法。冰冻切 片技术主要应用于：①确定病变性质。如某一送检标本是肿瘤性还是非肿瘤性病变；如果是肿瘤性病变，是良性肿 瘤、交界性肿瘤还是恶性肿瘤。②确定恶性肿瘤的扩散情况。如前哨淋巴结或肿瘤周围淋巴结是否有转移，肿瘤是 否浸润到邻近组织等。③确定手术切缘是否残留癌组织，以决定是否需要扩大手术范围。④鉴定切除标本的组织类 型。⑤证实组织内的脂类物质。⑥免疫荧光组织化学研究。如肾穿刺标本的IgA、IgG、IgM、C3、C4、C2、抗体轻 链等免疫荧光标记。⑦免疫酶组织化学和亲合免疫细胞化学研究。如肿瘤细胞内的某些抗原的保存，癌基因活性的 检测等常需要冷冻切片。⑧酶组织化学研究。如显示碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶、非特异性酯酶 等需要冷冻切片来保存酶的活性。   （二）低温恒冷冷冻切片的操作技术 1.操作步骤 (1)工作前1h应接通电源，打开开关，开机预冷，调节好冷冻室内温度，打开切片机运转旋钮，使之能前后调 节，当达到预选的冷冻室温度时方可工作。   (2)送检组织或实验动物组织，不加任何固定剂，必要时用生理盐水洗去血污，取材厚度不超过0.3cm.  (3)将湿滤纸贴于预冷冻的标本盘垫上冻结，然后将组织块粘贴在标本盘垫上，加上OCT包埋剂，用冷锤轻压其 上，速冻1-2min,使OCT固化呈乳白色。   (4)旋紧组织移动标本夹孔上的螺旋钮。  (5)电脑控制的冷冻切片机可开动切片程序（手摇冷冻切片机，则右手摇动切片机，左手移动粗调节按钮，先 削平组织块）。  (6)调整好防卷板和切片厚度微调，开始收集及附贴切片。（附贴方法根据冷冻切片的目的，可选用以下方 法：①将切片贴在载玻片或盖玻片（室温）上，稍待片刻，即浸于固定剂中固定或浸于冷的保护剂中。②将切片贴 在载玻片或盖玻片上干燥后固定，染色，观察（酶组织化学）。③将切片移入温或冷的孵育液中（酶组织化学）显 示、观察。④将切片贴在温或冷的其他试剂中（蛋白质和无机物的组织化学）。切片厚度一般为5-6μm，切出的片 子用载玻片贴附后立即放入A-F液（无水乙醇和甲醛液各半）中固定，固定时间为20～30s。  (7)水洗1-2min。  (8)Harris苏木素溶液1min。  (9)水洗1-2min。  (10)1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗。  (11)温水蓝化(或1%氨水返蓝30s)。  (12)1%伊红染色液5-10s。  (13)梯度乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固

2.结果细胞核蓝色,细胞浆、肌纤维、胶原纤维呈不同程度的红色,红细胞呈橙红色 该方法优点:制片迅速及时,切片质量好,染色鲜艳,较薄,有时较好的切片可与石蜡切片相似。由于组织内 生物活性物质保存好,可做各种组织化学、免疫荧光、免疫酶标等染色。被广泛应用于手术中病理切片诊断及科学 实验研究。缺点:设备昂贵,停电、无电等情况无法进行工作。 3.注意事项 (1)组织要新鲜,无需固定,立即送检,更不能用乙醇固定(乙醇固定后的组织无法冷凝),取材要平整,厚 薄均匀,理想厚度为2m,不能超过3mm,这样才能使组织冷冻均匀,易于切片。 (2)冷冻的温度要适宣,切片时要根据不同组织来设置最佳切片温度(-20℃至-30℃),温度过高或过低都会 造成切片困难 (3)选用固化温度在-20℃左右的0CT包埋剂覆盖好组织,组织周边不要暴露。 (4)包埋好的组织放在速冻台上速冻,加上冷锤,通常1-2min后0CT包埋剂凝固后即可进行切片,冷冻的时间 不宜过久,以免组织过硬,容易损伤刀刃和使组织变脆切不成片。如发现组织变脆,可将冷冻的组织取出,于室温 中停留片刻,再行切片 (5)切片刀一定要锋利,用一次性刀片效果更好,一般一个刀口切5-6个组织后即更换。 (6)调整好防卷板。(防卷板使用方法:将防卷板与切片刀调整平行,刀与刃面的距离约0.5-1m。)使用时不 要碰撞、划痕、缺损,要保持清洁卫生,一般常用75%乙醇清洗污迹,用棉花擦干。 (7)切片时用力均匀,避免转速不稳,时快时慢 (8)用于附贴切片的载玻片,不能放在冷冻的地方,在室温存放即可。因放在室温的载玻片与冷冻箱中的组织 片有一定温差,当温度较高的载玻片附上温度较低的组织切片时,由于温差分子的彼此转移而产生了一种吸附力, 使组织切片与载玻片牢固的附贴在一起

2.结果细胞核蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维呈不同程度的红色，红细胞呈橙红色。  该方法优点：制片迅速及时，切片质量好，染色鲜艳，较薄，有时较好的切片可与石蜡切片相似。由于组织内 生物活性物质保存好，可做各种组织化学、免疫荧光、免疫酶标等染色。被广泛应用于手术中病理切片诊断及科学 实验研究。缺点：设备昂贵，停电、无电等情况无法进行工作。   3.注意事项   (1)组织要新鲜，无需固定，立即送检，更不能用乙醇固定（乙醇固定后的组织无法冷凝），取材要平整，厚 薄均匀，理想厚度为2mm，不能超过3mm，这样才能使组织冷冻均匀，易于切片。   (2)冷冻的温度要适宜，切片时要根据不同组织来设置最佳切片温度（-20℃至-30℃），温度过高或过低都会 造成切片困难。  (3)选用固化温度在-20℃左右的OCT包埋剂覆盖好组织，组织周边不要暴露。   (4)包埋好的组织放在速冻台上速冻，加上冷锤，通常1-2min后OCT包埋剂凝固后即可进 行切片，冷冻的时间 不宜过久，以免组织过硬，容易损伤刀刃和使组织变脆切不成片。如发现组织变脆，可将冷冻的组织取出，于室温 中停留片刻，再行切片。   (5)切片刀一定要锋利，用一次性刀片效果更好，一般一个刀口切5-6个组织后即更换。   (6)调整好防卷板。（防卷板使用方法：将防卷板与切片刀调整平行，刀与刃面的距离约0.5-1mm。）使用时不 要碰撞、划痕、缺损，要保持清洁卫生，一般常用75%乙醇清洗污迹，用棉花擦干。   (7)切片时用力均匀，避免转速不稳，时快时慢。  (8)用于附贴切片的载玻片，不能放在冷冻的地方，在室温存放即可。因放在室温的载玻 片与冷冻箱中的组织 片有一定温差，当温度较高的载玻片附上温度较低的组织切片时，由于温差分子的彼此转移而产生了一种吸附力， 使组织切片与载玻片牢固的附贴在一起