《生理学》课程教学资源（文献资料）电生理学发展简史

电生理学发展简史 生物电活动是机体一种基本的生命现象，它产生的基础是细胞膜上离子通道 活动的总和效应。从生物电现象的发现到如今对离子通道功能与结构如此深入的 了解，电生理学走过了200多年的历程。 一、生物电现象的发现 最初的实验研究是从18世纪后叶开始的。当时没有任何测量电流的仪 器，只是发现利用电容器（如雷顿瓶）的放电，或雷电发生时竖起一根长导线， 引导大气中的电，都可以刺激蛙的神经肌肉标本，引起肌肉收缩，所以当时就用 蛙的神经肌肉标本作为电流存在的标志。1791年意大利解剖学教授Galvani L发现，如果将蛙腿的肌肉置于铁板上，再用铜钩钩住蛙的脊髓，当铜钩与 铁板接触时肌肉就会发生收缩。他把这个现象的发生归因于机体的“动物电” (animal electricity)。他认为神经与肌肉带有相反的电荷，肌肉带正电，神经 带负电，金属导体的作用是把神经与肌肉之间的电路接通。同时代的意大利物理 学家Volta A不同意Galvani的见解，他认为实验中发现的电现象，不是动物 机体产生的动物电，而是由于实验中连接肌肉和神经的金属不同所致，是不同金 属接触时产生的电流刺激了肌肉标本，如果用同一种金属作导体，收缩就不会发 生。事实上，Volta和Galvani的观点都有其正确的一面。Volta后来因此而 发明了伏特电池；Galvani则继续进行了一个出色的实验。在无金属参与的情 况下，他将一个肌肉标本横断，又将另一个神经肌肉标本的神经干搭在横断肌肉 上，并使之跨越肌肉的完好面和损伤面，结果该神经支配的肌肉产生收缩，证实 了动物电的存在。这成为第一次观察到生物电存在的电生理实验。但是直接测量 到生物电的实验是在电流计发明之后。 1825年意大利物理学家Nobili发明电流计。 l837年意大利物理学教授Matteucci C用电流计在肌肉的横断面与未损伤 部位之间，测量到电流流动，电流是从未损伤部位流向横断面的，所以横断面呈 负电位。这是第一次直接测量到生物体内存在生物电的实验。 1843年瑞士生理学家Du Bios-Reymond用电流计观察到神经的损伤电 位，也是损伤部位呈负性。1849年，他又发现神经在活动期间出现负波动，即 使用电流计从细胞外记录到的动作电位。 1850年von Helmholtz H测定了神经传导速度，证明蛙神经的传导速度仅 20~30ms。此前人们认为既然电的传导速度等于光速，因而神经的传导速度可 能也是光速。 二、早期对生物电发生机制的认识 1.Bernstein的膜学说对于这种生物电现象的解释，当时提出了不同的学 说。Du Bios-Reymond认为，组织内带负电，外表带正电，是正常状态下存在 的，即所谓“现存学说”（preexistence theory);而他的学生Hermann(Du Bios-Reymond)则认为，组织内的负电是被切割时组织损伤变质造成的，即所 谓“变质学说”(alteration theory)。I890年，著名的化学家Ostwald W提 出了膜的通透性理论，即如果在电解质弥散的途径上有一层半透膜，它只允许一 种离子通过，而带有相反电荷的另一种离子不能通过，就会通过静电作用限制透

电生理学发展简史 生物电活动是机体一种基本的生命现象，它产生的基础是细胞膜上离子通道 活动的总和效应。从生物电现象的发现到如今对离子通道功能与结构如此深入的 了解，电生理学走过了 200 多年的历程。 一、生物电现象的发现 最初的实验研究是从 18 世纪后 叶 开始的。当时没有任何测量电流的仪 器，只是发现利用电容器（如雷顿瓶）的放电 ， 或雷电发生时竖起一根长导线， 引导大气中的电，都可以刺激蛙的神经肌肉标本，引起肌肉收缩，所以当时就用 蛙的神经肌肉标本作为电流存在的标志。 1791 年意大 利解剖学 教授 Galvani L 发现，如果将蛙腿的肌肉置于铁板上，再用铜钩钩住蛙 的 脊髓，当铜钩与 铁板接触时肌肉就会发生收缩。他把这个现象的发生归因于机体的 “ 动物电 ” （ animal electricity ）。他认为神经与肌肉带有相反的电荷，肌肉带正电，神经 带负电，金属导体的作用是把神经与肌肉之间的电路接通。同时代的意大利物理 学家 Volta A 不同意 Galvani 的见解，他认为实验中发现的电现象，不是动物 机体产生的动物电，而是由于实验中连接肌肉和神经的金属不同所致，是不同金 属接触时产生的电流刺激了肌肉标本，如果用同一种金属作导体，收缩就不会发 生。事实上， Volta 和 Galvani 的观点都有其正确的一面。 Volta 后来因此而 发明了伏特电池； Galvani 则继续进行了一个出色的实验。在无金属参与的情 况下，他将一个肌肉标本横断，又将另一个神经肌肉标本的神经干搭在横断肌肉 上，并使之跨越肌肉的完好面和损伤面，结果该神经支配的肌肉产生收缩，证实 了动物电的存在。这成为第一次观察到生物电存在的电生理实验。但是直接测量 到生物电的实验是在电流计发明之后。 1825 年意大利物理学家 Nobili 发明电流计。 1837 年意大利物理学教授 Matteucci C 用电流计在肌肉的横断面与未损伤 部位之间，测量到电流流动，电流是从未损伤部位流向横断面的，所以横断面呈 负电位。这是第一次直接测量到生物体内存 在 生物电的实验。 1843 年瑞士生理学家 Du Bios-Reymond 用电流计观察到神经的损伤电 位，也是损伤部位呈负性。 1849 年，他又发现神经在活动期间出现负波动，即 使用电流计从细胞外记录到的动作电位。 1850 年 von Helmholtz H 测定了神经传导速度，证明蛙神经的传导速度仅 20 ~ 30m/s 。此前人们认为既然电的传导速度等于光速，因而神经的传导速度可 能也是光速。 二、早期对生物电发生机制的认识 1. Bernstein 的膜学说 对于这种生物电现象的解释，当时提出了不同的学 说。 Du Bios-Reymond 认为，组织内带负电，外表带正电，是正常状态下存在 的，即所谓 “ 现存学说 ” （ preexistence theory ）；而他的学生 Hermann （ Du Bios-Reymond ）则认为，组织内的负电是被切割时组织损伤变质造成的，即所 谓 “ 变质学说 ” （ alteration theory ）。1890 年，著名的化学家 Ostwald W 提 出了膜的通透性理论，即如果在电解质弥散的途径上有一层半透膜，它只允许一 种离子通过，而带有相反电荷的另一种离子不能通过，就会通过静电作用限制透

过膜的离子不能进一步弥散，如此，在膜两侧就会形成电位差，它的大小可按 Nernst公式计算。I902年Du Bios-Reymond的另一名学生Bernstein J接受 了Ostwald通透性理论，在现存学说的基础上提出了“膜学说”(membrane theory)。他根据细胞内液比细胞外液含较多的K+,而细胞损伤处电位较完 好处为低的事实，推测静息时细胞内电位低于细胞外，并假定静息时细胞膜只对 K+有通透性，由于胞内带正电荷的K+顺浓度差扩散到膜外，相应的负电荷 仍留在膜内，使细胞膜呈现外正内负的极化状态，形成静息电位。按照Bernstein 的设想，细胞的静息电位就等于K+的平衡电位。动作电位则是由于膜在一瞬 间失去了对K+的选择性通透，变得对所有离子通透性一过性地升高，导致膜 两侧电位差瞬间消失。1904年，他又设计了一个精巧的实验，证实肌肉切断后 断面的负电位在0.3s后即出现，并持续缓慢地减小而不是逐渐增大，从而用事 实否定了变质学说。因此膜学说在此后30多年的时间内为多数人所接受，不过 它却一直未能得到实验证实。这是因为要想测量膜两侧的电位差，必须要将一个 电极插入细胞内，这就要求插入的记录电极直径很细，不能损伤细胞：插入处也 不能漏电。显然，这种技术上的限制在当时是很难克服的。 2.细胞跨膜电位的记录1936年，生物学家Young JZ发现了头足类软体 动物枪乌铡的巨大神经轴突，其直径可达1mm。这与最大直径不超过20μm的 脊椎动物神经纤维相比，无疑是研究跨膜电位的绝好材料。1939年，英国生理 学家Hodgkin AL和Huxley AF将直径为O.lmm,内部充满海水的毛细玻璃 管纵向插入枪乌侧大神经轴突（直径0.5m)的断端，作为细胞内电极，而将 另一电极置于浸泡细胞的海水中，于是在毛细管尖端和细胞外电极之间记录到约 60mV的电位差，胞质为负。将轴浆内电极靠近膜内侧或向中心移动，电位差 均不变，表明电位差存在于膜的两侧。这样，他们便利用枪乌鲗巨大轴突首 次记录到膜两侧的静息电位。这一工作的意义在于实验测定的静息电位与根据细 胞膜内、外钾浓度经Nernst公式计算的钾平衡电位(-75mV)非常接近，从 而有力地支持了Bernstein关于静息电位状态下细胞膜选择性对钾离子有通透 性的膜学说。但是，正如在图1中所看到的，实测的静息电位值总是略小于K +平衡电位，这说明细胞膜并不是像原来设想的那样只对K+有通透性，而可 能对其他离子，特别是Na+亦有一定的通透性。 20] ●=实际测得的 桥总电位 40 60 my 80 100 120 克K-59.51o%10139 140 160 06 16203030 [k。 (mmol) 图1细胞外K+浓度对蛙缝匠肌静息电位的影响

过膜的离子不能进一步弥散，如 此 ，在膜两侧就会形成电位差，它的大小可按 Nernst 公式计算。 1902 年 Du Bios-Reymond 的另一名学生 Bernstein J 接受 了 Ostwald 通透性理论，在现存学说的基础上提出了 “ 膜学说 ” （ membrane theory ）。他根据细胞内液比细胞外液含较多的 K + ，而细胞损伤处电位较完 好处为低的事实，推测静息时细胞内电位低于细胞外，并假定静息时细胞膜只对 K + 有通透性，由于胞内带正电荷的 K + 顺浓度差扩散到膜外，相应的负电荷 仍留在膜内，使细胞膜呈现外正内负的极化状态，形成静息电位。按照 Bernstein 的设想，细胞的静息电位就等于 K + 的平衡电位。动作电位则是由于膜在一瞬 间失去了对 K + 的选择性通透，变得对所有离子通透性一过性地升高，导致膜 两侧电位差瞬间消失。 1904 年，他又设计了一个精巧的实验，证实肌肉切断后 断面的负电位在 0.3 s 后即出现，并持续缓慢地减小而不是逐渐增大，从而用事 实否定了变质学说。因此膜学说在此后 30 多年的时间内为多数人所接受，不过 它却一直未能得到实验证实。这是因为要想测量膜两侧的电位差，必须要将一个 电极插入细胞内，这就要求插入的记录电极直径很细，不能损伤细胞；插入处也 不能漏电。显然，这种技术上的限制在当时是很难克服的。 2. 细胞跨膜电位的记录 1936 年，生物学家 Young JZ 发现了头足类软体 动物枪乌鲗的巨大神经轴突，其直径可达 1mm 。这与最大直径不超过 20μm 的 脊椎动物神经纤维相比，无疑是研究跨膜电位的绝好材料。 1939 年，英国生理 学家 Hodgkin AL 和 Huxley AF 将直径为 0.1mm ，内部充满海水的毛细玻璃 管纵向插入枪乌鲗大神经轴突（直径 0.5mm ）的断端，作为细胞内电极，而将 另一电极置于浸泡细胞的海水中，于是在毛细管尖端和细胞外电极之间记录到约 60mV 的电位差，胞 质 为负。将轴浆内电极靠近膜内侧或向中心移动，电位差 均不变，表明电位差存在于膜的两侧。这样，他们便利用枪乌 鲗 巨 大 轴突首 次记录到膜两侧的静息电位。这一工作的意义在于实验测定的静息电位与根据细 胞膜内、外钾浓度经 Nernst 公式计算的钾平衡电位（ - 75mV ）非常接近，从 而有力地支持了 Bernstein 关于静息电位状态下细胞膜选择性对钾离子有通透 性的膜学说。但是，正如在图 1 中所看到的，实测的静息电位值总是略小于 K + 平衡电位，这说明细胞膜并不是像原来设想的那样只对 K + 有通透性，而可 能对其他离子，特别是 Na + 亦有一定的通透性。 图 1 细胞外 K + 浓度对蛙缝匠肌静息电位的影响

图中的圆点是不同K+浓度时静息电位的实测值：直线是根据Nernst公式的计 算值 膜学说关于动作电位产生机制的解释也得到膜阻抗测量实验的支持。1939 年，Cole KS和Curtis HJ利用惠斯登电桥(Wheatstone bridge)观测枪乌鲗 巨大轴突动作电位期间膜电阻和膜电容的变化，发现动作电位期间膜电容基本 不变，而膜阻抗显著降低（膜电导增大）（图2），由静息时的10002cm2下 降到252cm2,支持动作电位期间膜对多种离子通透性的增大。 公 动作电位 膜电导 图2 Wheatstone电桥对动作电位期间膜阻抗的测定 A：测量膜电容和阻抗的AC Wheatstone电桥，电桥施加高频交变电流， 输出端为振幅相同的175kHz的交流信号。R1、R2为已知电阻，RV、CV 为可调电阻和电容（数值可读），当R1=R2,RV=Rx,Cv=Cx时 电桥平衡，由此可求出Rx和Cx；B:冲动通过枪乌鲗巨大轴突时膜 阻抗的变化：静息下电桥处于平衡状态，为振幅很小的细线：电桥失衡（由于膜 阻抗降低)时为振幅增大的宽带。 但是，Hodgkin和Huxley利用细胞内电极在记录枪乌鲫巨轴突静息电位 的基础上观测受刺激后产生的动作电位时，却使人意外地发现，动作电位的幅度 大大超过了零电位(+30~+50V),出现膜电位的倒转（超射），这是用膜 对各种离子通透性普遍增大的理论无法解释的。考虑到经公式计算的钠平衡电位 在+50mV至+70mV,Hodgkin和Huxley提出了一个新的“离子学说”， 即动作电位期间膜对钠通透性瞬间增大并远远超过了对钾的通透性。 3.Hodgkin的离子学说1949年Hodgkin和Huxley用氯化胆碱或葡萄糖 等张地替代神经纤维周围海水中的NaCI,结果表明，这种状况下的动作电位 幅度、升支上升速度和动作电位传导速度都下降了，其下降程度随钠离子被替代 比例的增大而增大（图3），从而证实了他们的离子学说，即安静时选择性地 对钾通透，而兴奋时对钠的通透性瞬间增大。1951年，Keynes和Lewis利 用同位素24Na+的定量研究也证明，在给予枪乌铡神经巨大轴突几分钟连续 刺激后，浸浴液中的24Na+大量进入轴浆，经计算，每次动作电位进入细胞内 的Na+约为21000/mm2。如果细胞膜的膜电容为1mF/cm2,这一Na+流 量足以使膜去极化达100mV以上。不过这种实验还不能分析动作电位期间的 Na+内流和膜对Na+通透性变化的精确的时间过程

图中的圆点是不同 K + 浓度时静息电位的实测值；直线是根据 Nernst 公式的计 算值 膜学说关于动作电位产生机制的解释也得到膜阻抗测量实验的支持。 1939 年， Cole KS 和 Curtis HJ 利用惠斯登电桥（ Wheatstone bridge ）观测枪乌鲗 巨 大 轴突动作电位期间膜电阻和膜电容的变化，发现动作电位期间膜电容基本 不变，而膜阻抗显著降低（膜电导增大）（图 2 ），由静息时的 1000Ωcm 2 下 降到 25Ωcm 2 ，支持动作电位期间膜对多种离子通透性的增大。 图 2 Wheatstone 电桥对动作电位期间膜阻抗的测定 A ：测量膜电容和阻抗的 AC Wheatstone 电桥，电桥施加高频交变电流， 输出端为振幅相同的 175kHz 的交流信号。 R1 、 R2 为已知电阻， Rv 、 Cv 为可调电阻和电容（数值可读） , 当 R1 ＝ R2， Rv ＝ Rx ， Cv ＝ Cx 时 电桥平衡，由此可求出 Rx 和 Cx ； B ：冲动通过枪乌鲗 巨 大轴突时膜 阻抗的变化：静息下电桥处于平衡状态，为振幅很小的细线；电桥失衡（由于膜 阻抗降低）时为振幅增大的宽带。 但是， Hodgkin 和 Huxley 利用细胞内电极在记录枪乌鲗巨轴突静息电位 的基础上观测受刺激后产生的动作电位时，却使人意外地发现，动作电位的幅度 大大超过了零电位（ + 30 ~+ 50mV ），出现膜电位的倒转（超射），这是用膜 对各种离子通透性普遍增大的理论无法解释的。考虑到经公式计算的钠平衡电位 在 +50mV 至 +70mV ，Hodgkin 和 Huxley 提出了一个新的 “ 离子学说 ” ， 即动作电位期间膜对钠通透性瞬间增大并远远超过了对钾的通透性。 3. Hodgkin 的离子学说 1949 年 Hodgkin 和 Huxley 用氯化胆碱或葡萄糖 等张地替代神经纤维周围海水中的 NaCl ，结果表明，这种状况下的动作电位 幅度、升支上升速度和动作电位传导速度都下降了，其下降程度随钠离子被替代 比例的增大而增大（图 3 ），从而证实了他们的离子学说，即安静时选择性地 对钾通透，而兴奋时对钠的通透性瞬间增大。 1951 年， Keynes 和 Lewis 利 用同位素 24 Na + 的定量研究也证明，在给予枪乌鲗神经 巨 大轴突几分钟连续 刺激后，浸浴液中的 24 Na + 大量进入轴浆，经计算，每次动作电位进入细胞内 的 Na + 约为 21000/ mm 2 。如果细胞膜的膜电容为 1 m F/cm 2 ，这一 Na + 流 量足以使膜去极化达 100mV 以上。不过这种实验还不能分析动作电位期间的 Na + 内流和膜对 Na + 通透性变化的精确的时间过程

my -40 -20 8 +40 +60 +80 E mV -20 0 +20 440 +80 mV -40 -20 +20 +60 *80日 10 ke/s 图3降低细胞外N+浓度对枪乌鲗巨轴突动作电位的影响 图中1和3分别为实验前和实验后海水灌流的反应， 2为实验灌流液，由海水和等张的葡萄糖溶液混合配制， 其中海水所占比例为a,33%:b,50%;c,71% 1949年Ling和Gerard创立了微电极技术，使人们有可能对多种细胞作 细胞内电位的直接测量。各类可兴奋细胞上所测得的静息电位与动作电位大致与 上述情况相似。 4.探讨动作电位期间膜对离子通透性的变化一一电压钳技术的建立及其 贡献细胞膜对动作电位期间离子通透性（膜电导）变化的直接测定是从应用电 压钳(voltage clamp)技术以后开始的。该技术是1949年由Cole KS及 Marmont G设计的，后经Hodgkin和Huxley和Katz等加以改进，并成功地 应用于枪乌鲗巨轴突动作电位期间离子电流的研究。电压钳技术的基本原理就 是欧姆定律，即： I m=g V m 式中g为膜电导，Vm为膜电位，Im为膜电流。该式表明，为了测定 动作电位期间膜电导g的变化，只要膜电位Vm保持不变，膜电流Im就可 以作为观测膜电导g变化的指标。但事实上，动作电位期间V发生了快速 变化，使膜电导g与膜电位V互为因变量，又夹杂产生了大量的电容电流， 从而使Im的测量失去意义。电压钳技术就是为了克服这一困难而设计的。它 通过一个反馈电路向膜内注入电流迫使Vm保持恒定，此时Im的变化就可 反映g的变化

图 3 降低细胞外 Na + 浓度对枪乌鲗巨轴突动作电位的影响 图中 1 和 3 分别为实验前和实验后海水灌流的反应， 2 为实验灌流液，由海水和等张的葡萄糖溶液混合配制， 其中海水所占比例为 a, 33%； b, 50%；c, 71% 1949 年 Ling 和 Gerard 创立了微电极技术，使人们有可能对多种细胞作 细胞内电位的直接测量。各类可兴奋细胞上所测得的静息电位与动作电位大致与 上述情况相似 。 4. 探讨动作电位期间膜对离子通透性的变化 ―― 电压钳技术的建立及其 贡献 细胞膜对动作电位期间离子通透性（膜电导）变化的直接测定是从应用电 压钳（ voltage clamp ）技术以后开始的。该技术是 1949 年由 Cole KS 及 Marmont G 设计的，后经 Hodgkin 和 Huxley 和 Katz 等加以改进，并成功地 应用于枪乌 鲗 巨轴突动作电位期间离子电流的研究。电压钳技术的基本原理就 是欧姆定律，即 ： I m = g·V m 式中 g 为膜电导， V m 为膜电位， I m 为膜电流。该式表明，为了测定 动作电位期间膜电导 g 的变化，只要膜电位 V m 保持不变，膜电流 I m 就可 以作为观测膜电导 g 变化的指标。但事实上，动作电位期间 V m 发生了快速 变化，使膜电导 g 与膜电位 V m 互为因变量，又夹杂产生了大量的电容电流， 从而使 I m 的测量失去意义。电压钳技术就是为了克服这一困难而设计的。它 通过一个反馈电路向膜内注入电流迫使 V m 保持恒定，此时 I m 的变化就可 反映 g 的变化

图4就是这一技术的示意图。Hodgkin和Huxley利用电压钳技术，直接测定 了动作电位期间的膜电流，推算出钠电导和钾电导的变化，并用一组数学模型方 程式，定量地描述了这个变化过程，很好地模拟了包括动作电位形状在内的可兴 奋膜的各种兴奋与传导的特性。他们提出的描述电压门控通道门控动力学的基本 概念至今仍被沿用。他们也因此荣获1963年度诺贝尔生理学或医学奖。 A 图4电压钳技术示意图 A:纵向电极法；B:双微电极法 FBA:反馈放大器：E:监测膜电位，C:指令膜电位；P:注射电流：I: 记录电流。FBA的两个输入端除接受膜电位E的输入外，另一个接受指令电 位C,当两者电位相等时输出电流为零，当两者出现差异时，FBA经电极 输出电流，电流穿越细胞膜流出产生电压变化，使E趋向于C,如此便构成 个使膜电位始终保持于C的负反馈回路 三、离子通道概念的提出 1955年，Hodgkin和Keynes首次提出细胞膜上含有离子通道(ion channel),它们分别对某种离子有选择性的通透能力，并且通过自己的“开放” 或“关闭”等状态的改变而影响和决定膜对某种离子的通透性。此后，陆续 发现一些毒物或药物能够选择性地阻断膜对某些离子的通透，如河豚毒可以选择 性地阻断膜对Na+的通透而不影响对K+的通透，四乙铵则可影响膜对K+ 的通透而不影响对Na+的通透。这些毒物或药物的作用很可能就是特异地结合 了膜上与某种离子通透有关的通道结构。有人用同位素标记的河豚毒做实验，发 现它们只和细胞膜上散在的一些蛋白质分子作1：1的结合，并可由此算出Na +通道的密度。Na+通道在枪乌鲗巨大轴突膜上的密度约为每平方微米550 个，在兔迷走神经纤维膜上约为100个，在一些有髓鞘神经纤维朗飞结处的膜 上可达104~105个。如果把计算所得的Na+通道数目和膜兴奋时的Na+ 内流量作比较，则可得到兴奋时每秒钟将有多于107个Na+流过Na+通道。 这个速率超过钠泵主动转运Na+速度的105倍，比体内一般酶反应的转换速 率快100倍。再加上此速率的温度系数较低，Q10(即温度每增加10度速 率增加的倍数)与Na+在水中自由扩散系数的Q10相近似，因此可以设想， 当膜对Na+的通透性增加时，膜上的钠通道蛋白结构中打开了某种水相孔洞。 因此，如何能观测到这种推测中的单个离子通道的活动，以证实膜上离子通道的 存在，成为当时许多研究者追求的目标。后来膜片钳技术的建立圆满地解决了上 述问题，但是在此之前有两个技术曾为人们认识单通道活动的特征和启发膜片钳

图 4 就是这一技术的示意图。 Hodgkin 和 Huxley 利用电压钳技术，直接测定 了动作电位期间的膜电流，推算出钠电导和钾电导的变化，并用一组数学模型方 程式，定量地描述了这个变化过程，很好地模拟了包括动作电位形状在内的可兴 奋膜的各种兴奋与传导的特性。他们提出的描述电压门控通道门控动力学的基本 概念至今仍被沿用。他们也因此荣获 1963 年度诺贝尔生理学 或医学奖。 图 4 电压钳技术示意图 A ：纵向电极法； B ：双微电极法 FBA ：反馈放大器； E ：监测膜电位， C ：指令膜电位； I' ：注射电流； I ： 记录电流。 FBA 的两个输入端除接受膜电位 E 的输入外，另一个接受指令电 位 C ，当两者电位相等时输出电流为零，当两者出现差异时， FBA 经电极 I' 输出电流，电流穿越细胞膜流出产生电压变化，使 E 趋向于 C ，如此便构成 一个使膜电位始终保持于 C 的负反馈回路 三、离子通道概念的提出 1955 年， Hodgkin 和 Keynes 首次提出细胞膜上含有离子通道（ ion channel ），它们分别对某种离子有选择性的通透能力，并且通过自己的 “ 开放 ” 或 “ 关闭 ” 等 状态的改变而影响和决定膜对某种离子的通透性。此后，陆续 发现一些毒物或药物能够选择性地阻断膜对某些离子的通透，如河豚毒可以选择 性地阻断膜对 Na + 的通透而不影响对 K + 的通透，四乙铵则可影响膜对 K + 的通透而不影响对 Na + 的通透。这些毒物或药物的作用很可能就是特异地结合 了膜上与某种离子通透有关的通道结构。有人用同位素标记的河豚毒做实验，发 现它们只和细胞膜上散在的一些蛋白质分子作 1 ∶ 1 的结合，并可由此算出 Na + 通道的密度。 Na + 通道在枪乌 鲗 巨大轴突膜上的密度约为每平方微米 550 个，在兔迷走神经纤维膜上约为 100 个，在一些有髓鞘神经纤维朗飞结处的膜 上可达 10 4 ~ 10 5 个。如果把计算所得的 Na + 通道数目和膜兴奋时的 Na + 内流量作比较，则可得到兴奋时每秒钟将有多于 10 7 个 Na + 流过 Na + 通道。 这个速率超过钠泵主动转运 Na + 速度的 10 5 倍，比体内一般酶反应的转换速 率快 100 倍。再加上此速率的温度系数较低， Q 10 （即温度每增加 10 度速 率增加的倍数）与 Na + 在水中自由扩散系数的 Q 10 相近似，因此可以设想， 当膜对 Na + 的通透性增加时，膜上的钠通道蛋白结构中打开了某种水相孔洞。 因此，如何能观测到这种推测中的单个离子通道的活动，以证实膜上离子通道的 存在，成为当时许多研究者追求的目标。后来膜片钳技术的建立圆满地解决了上 述问题，但是在此之前有两个技术曾为人们认识单通道活动的特征和启发膜片钳

技术的思路做出了贡献，它们是波动分析(fluctuation analysis)技术和人 工脂膜(artificial lipid bilayers)技术。 四、单通道电流的记录一一膜片钳技术的建立和发展 1969年Bean等将电压钳技术应用于塑料隔板小孔上形成的小片人工脂 膜，他们发现在几乎绝缘的人工脂质双层中掺入少量的细菌蛋白后，脂膜成为可 导电的，并记录到断续的阶梯状的跨膜电流。I970年Hadky和Haydon在同 样的人工脂膜中掺入少量的短杆菌肽(gramicidin)，也记录到形式相同的跨 膜电流（图5）。这些证据表明，阶梯样电流是由于搀入了能形成孔洞样结构 的蛋白质所致，每一阶梯反映了单个通道蛋白分子的开放和关闭。因此，单通道 的电活动是首先在人工脂膜上记录到的。 - 膜电 开救 开枚 关闭 0.5pA 2ms -257+ 图5人工脂膜上单通道电流的特征 上方：短杆菌肽A加入人工脂膜形成二聚体的离子通道 下方：从含有短杆菌肽A的人工脂膜上记录的单通道电流 1973年，Anderson和Stevens利用波动分析（也称噪声分析）结合电压钳 技术研究了天然细胞膜上单个离子通道的特征，他们在蛙骨骼肌终板区成功地分 析了N2~型乙酰胆碱受体阳离子通道的单通道电导和平均开放时间，所得数值 与后来经膜片钳测定的数值非常接近。 人工脂膜和波动分析取得的成果极大地鼓舞了生理学家去探索更合适的方法 来直接从生物膜上观测单个离子通道的电活动，以揭示生物电信号的微观世界。 要实现这一目标，首先要解决的就是背景噪声问题。单通道电流仅1~2pA(图 5),而背景噪声要大得多，例如用细胞内微电极在肌纤维做电压钳时，膜在安 静状态（无乙酰胆碱）下的噪声峰·峰值可达200pA,因此要想记录到单通道 电流至少要使背景噪声减少100倍，而要精确测量则至少要降低1000倍。根 据Johnson噪声公式，膜电流噪声的方差o可由下式决定： o=4KTfc/R

技术的思路 做 出了贡献，它们是波动分析 （ fluctuation analysis ） 技术和人 工脂膜（ artificial lipid bilayers ）技术。 四、单通道电流的记录 ―― 膜片钳技术的建立和发展 1969 年 Bean 等将电压钳技术应用于塑料隔板小孔上形成的小片人工脂 膜，他们发现在几乎绝缘的人工脂质双层中掺入少量的细菌蛋白后，脂膜成为可 导电的，并记录到断续的阶梯状的跨膜电流。 1970 年 Hadky 和 Haydon 在同 样的人工脂膜中掺入少量的短杆菌肽（ gramicidin ） , 也记录到形式相同的跨 膜电流（图 5 ）。这些证据表明，阶梯样电流是由于搀入了能形成孔洞样结构 的蛋白质所致，每一阶梯反映了单个通道蛋白分子的开放和关闭。因此，单通道 的电活动是首先在人工脂膜上记录到的。 图 5 人工脂膜上单通道电流的特征 上方：短杆菌肽 A 加入人工脂膜形成二聚体的离子通道 下方：从含有短杆菌肽 A 的人工脂膜上记录的单通道电流 1973 年， Anderson 和 Stevens 利用波动分析（也称噪声分析）结合电压钳 技术研究了天然细胞膜上单个离子通道的特征，他们在蛙骨骼肌终板区成功地分 析了 N 2 - 型乙酰胆碱受体阳离子通道的单通道电导和平均开放时间，所得数值 与后来经膜片钳测定的数值非常接近。 人工脂膜和波动分析取得的成果极大地鼓舞了生理学家去探索更合适的方法 来直接从生物膜上观测单个离子通道的电活动，以揭示生物电信号的微观世界。 要实现这一目标，首先要解决的就是背景噪声问题。单通道电流仅 1~2pA （图 5 ），而背景噪声要大得多，例如用细胞内微电极在肌纤维做电压钳时，膜在安 静状态（无乙酰胆碱）下的噪声峰 - 峰值可达 200pA ，因此要想记录到单通道 电流至少要使背景噪声减少 100 倍，而要精确测量则至少要降低 1000 倍。根 据 Johnson 噪声公式，膜电流噪声的方差 σ 可由下式决定： σ=4KTfc/R

此处K为Boltzmann常数，T为绝对温度，fc为截止频率，R为信 号源内阻。按上式计算，只有膜电阻高达2G2(2×1092)时噪声水平才能减低 到可以观测1pA波幅和1s波宽的信号，而要提高膜电阻，只能减少被测膜 的面积，当被测膜面积小于50um2时，信号源电阻即可达2G2以上。这种思 路引导Neher E和Sakmann B从细胞膜上游离一小片膜来实施电压钳，也就是 要使只包含几个离子通道的小片膜在电学上与细胞膜的其它部分完全隔离，从而 在不受细胞整体膜噪声的影响下实现通道电流的记录。他们用尖端直径几微米的 玻璃吸管作为电极（尖端经热抛光，内充盐溶液），轻压在蛙去神经肌纤维膜表 面，如果电极尖端的边缘与肌膜封接良好，就能实现小片膜在电学上与周围完全 隔离的效果，如果封接不良，电极尖端边缘与膜之间就会产生漏流，同样会使噪 声增大。因此，电极与膜的封接是膜片钳技术成败的一个关键因素。1976年， Neher和Sakmann用这种方法完成了电阻为50M2的封接，并首次在细胞膜 上记录到单通道电流。但是，当时实验记录的背景噪声仍然较大，电流的分析遇 到困难。正当人们用各种方法加以改进未能奏效而几乎放弃努力时，Neher于 1980年在一次实验中偶然地向吸管电极内施加了一点负压(20-30cH20), 封接电阻骤然增大了两个数量级，达到10~100G2,背景噪声显著减低（图6）。 后来将这种电阻大于giga2(1092)的封接称为giga-seal。1981年，Hamill 等在实现giga-seal的基础上建立了膜片钳记录的4种基本模式，即细胞贴附 膜片、膜内面向外膜片、膜外面向外膜片和全细胞记录。在此基础上，以后又发 展了许多新的记录模式，如穿孔膜片钳记录方式、巨膜片记录方式、松散封接记 录方式、膜电容测定技术等，从而大大扩展了它的应用领域。1991年，膜片钳 技术(patch clamp technique)的创始人Neher和Sakmann荣获诺贝尔生理 学或医学奖。 2p 图6膜片钳微电极与细胞表面紧密封接的形成 A:微电极置于细胞面表形成MΩ的封接，记录电流噪声很大； B:电极内施加轻微负压，封接电阻由M2级增加到10~100G2,背景噪声显 著减低 膜片钳记录的单通道电流(single channel current),使我们从功能上观测 到了离子通道的活动，并且证实离子通道的活动是整个细胞电活动的基本单位。 图5就是利用膜片钳技术记录的典型的单通道电流。可见单个通道的开闭是全 或无式的，每次开放可产生皮安级(pA,10~12安培)的电流，每次停留 于开放或关闭状态的时间是随机的。由于开、闭状态之间的转换速度非常快，因

此处 K 为 Boltzmann 常数， T 为绝对温度， fc 为截止频率， R 为信 号源内阻。按上式计算，只有膜电阻高达 2G Ω(2 × 10 9 Ω) 时噪声水平才能减低 到可以观测 1pA 波幅和 1ms 波宽的信号，而要提高膜电阻，只能减少被测膜 的面积，当被测膜面积小于 50μm 2 时，信号源电阻即可达 2GΩ 以上。这种思 路引导 Neher E 和 Sakmann B 从细胞膜上游离一小片膜来实施电压钳，也就是 要使只包含几个离子通道的小片膜在电学上与细胞膜的其它部分完全隔离，从而 在不受细胞整体膜噪声的影响下实现通道电流的记录。他们用尖端直径几微米的 玻璃吸管作为电极（尖端经热抛光，内充盐溶液），轻压在蛙去神经肌纤维膜表 面，如果电极尖端的边缘与肌膜封接良好，就能实现小片膜在电学上与周围完全 隔离的效果，如果封接不良，电极尖端边缘与膜之间就会产生漏流，同样会使噪 声增大。因此，电极与膜的封接是膜片钳技术成败的一个关键因素。 1976 年 ， Neher 和 Sakmann 用这种方法完成了电阻为 50M Ω 的封接，并首次在细胞膜 上记录到单通道电流。但是，当时实验记录的背景噪声仍然较大，电流的分析遇 到困难。正当人们用各种方法加以改进未能奏效而几乎放弃努力时， Neher 于 1980 年在一次实验中偶然地向吸管电极内施加了一点负压（ 20~30cmH 2 O ）， 封接电阻骤然增大了两个数量级，达到 10~100GΩ ，背景噪声显著减低（图 6 ）。 后来将这种电阻大于 gigaΩ(10 9 Ω) 的封接称为 giga-seal 。 1981 年， Hamill 等在实现 giga-seal 的基础上建立了膜片钳记录的 4 种基本模式，即细胞贴附 膜片、膜内面向外膜片、膜外面向外膜片和全细胞记录。在此基础上，以后又发 展了许多新的记录模式，如穿孔膜片钳记录方式、巨膜片记录方式、松散封接记 录方式、膜电容测定技术等，从而大大扩展了它的应用领域。 1991 年，膜片钳 技术（ patch clamp technique ）的创始人 Neher 和 Sakmann 荣获诺贝尔生理 学 或医学奖。 图 6 膜片钳微电极与细胞表面紧密封接的形成 A ：微电极置于细胞面表形成 MΩ 的封接，记录电流噪声很大； B: 电极内施加轻微负压，封接电阻由 MΩ 级增加到 10 ~100G Ω ，背景噪声显 著减低 膜片钳记录的单通道电流（ single channel current ），使我们从功能上观测 到了离子通道的活动，并且证实离子通道的活动是整个细胞电活动的基本单位。 图 5 就是利用膜片钳技术记录的典型的单通道电流。可见单个通道的开闭是全 或无式的，每次开放可产生皮安级（ pA ， 10 ~ 12 安培）的电流，每次停留 于开放或关闭状态的时间是随机的。由于开、闭状态之间的转换速度非常快，因

而单通道电流都表现为一个个宽窄不同的方波。利用计算机将大量单通道电流叠 加平均后所得的总体平均电流（图7），与在全细胞或一段神经纤维上经典电 压钳技术记录的膜电流，也称宏膜电流（macroscopical current),非常相似， 说明宏膜电流就是许多随机开放的单通道电流总和形成的。因此，利用膜片钳对 单通道活动的研究，揭示了动作电位期间膜电导的变化，以及由此引起的膜电流 变化，都是膜上不同种类的、大量的离子通道的开放和关闭造成的。 A Vo Ip 5 pA 0.2p 10ms 图7单通道电流与总体平均电流 A：电压钳制程序；B:9次钳制脉冲下记录到的单通道电流： C:300次钳制脉冲记录的总体平均电 五、对离子通道结构与功能的深入研究 上世纪80年代初期，利用膜片钳技术已从功能上证实了离子通道的存在， 然而揭示这种功能活动的结构基础，是许多生物学技术结合应用的成果。 1.通道蛋白一级结构的研究一一膜片钳技术与生化学和基因分子克隆技 术的结合为了研究离子通道的分子结构，首先需要利用生化学方法从富含某种 通道蛋白的组织中提取和纯化通道蛋白（图8）。这其中最关键的环节是找到 富含钠通道蛋白的组织和具有高度选择性与亲和力的毒素或药物。例如，乙酰胆 碱通道蛋白和电压门控钠通道蛋白是两个最早被分离纯化的通道蛋白，这主要得 益于发现了电鳐电器管和电鳗电器管分别富含乙酰胆碱通道蛋白和电压门控钠 通道蛋白，而银环蛇毒和河豚毒又分别是能与上述两个通道蛋白以高特异性 和高亲和力结合的两个毒素。然而通道蛋白都是分子量很大的蛋白质，利用化学 分析法测定全部氨基酸序列显然是不可能的

而单通道电流都表现为一个个宽窄不同的方波。利用计算机将大量单通道电流叠 加平均后所得的总体平均电流（图 7 ），与在全细胞或一段神经纤维上经典电 压钳技术记录的膜电流，也称宏膜电流（ macroscopical current ），非常相似， 说明宏膜电流就是许多随机开放的单通道电流总和形成的。因此，利用膜片钳对 单通道活动的研究，揭示了动作电位期间膜电导的变化，以及由此引起的膜电流 变化，都是膜上不同种类的、大量的离子通道的开放和关闭造成的。 图 7 单通道电流与总体平均电流 A ：电压钳制程序； B ： 9 次钳制脉冲下记录到的单通道电流； C ： 300 次钳制脉冲记录的总体平均电 五、对离子通道结构与功能的深入研究 上世纪 80 年代初期，利用膜片钳技术已从功能上证实了离子通道的存在， 然而揭示这种功能活动的结构基础，是许多生物学技术结合应用的成果。 1. 通道蛋白一级结构的研究 ―― 膜片钳技术与生化学和基因分子克隆技 术的结合 为了研究离子通道的分子结构，首先需要利用生化学方法从富含某种 通道蛋白的组织中提取和纯化通道蛋白（图 8 ）。这其中最关键的环节是找到 富含钠通道蛋白的组织和具有高度选择性与亲和力的毒素或药物。例如，乙酰胆 碱通道蛋白和电压门控钠通道蛋白是两个最早被分离纯化的通道蛋白，这主要得 益于发现了电鳐电器管和电鳗电器管分别富含乙酰胆碱通道蛋白和电压门控钠 通道蛋白，而 a 银环蛇毒和河豚毒又分别是能与上述两个通道蛋白以高特异性 和高亲和力结合的两个毒素。然而通道蛋白都是分子量很大的蛋白质，利用化学 分析法测定全部氨基酸序列显然是不可能的

品 电顿 制备电鳗电器管匀浆 离心 加入去垢剂分离膜蛋白 23 09698 机能重组入人工脂膜 电泳鉴别通 利用阿豚毒亲和 根据分子量、 道的亚单位 层析分离通道蛋白 带电性质等对 膜蛋白初步分辨 图8钠通道蛋白的纯化 对通道蛋白分子结构的进一步认识是利用了l973年Cohen等创建的 DNA重组技术(DNA recombination technique)。即通过测定纯化的通道蛋白 肽链的部分氨基酸残基序列，推衍出对应的DNA序列，选择部分序列制备通 道蛋白的寡聚核苷酸探针，用于从不同组织来源的DNA文库中筛选同源的通 道蛋白基因，再推衍出通道蛋白肽链的氨基酸残基序列（图9）。1982年， Noda等用DNA重组技术，首先完成了编码N2,型乙酰胆碱受体阳离子通道 基因的分子克隆，这是第一个被阐明氨基酸序列的通道蛋白。1984年，Noda 等又克隆了编码电压门控钠通道a亚基的基因。I987年，Tanabe等利用同 样的方法，完成了兔骨骼肌L型钙通道ā1亚基基因的克隆。钾通道的分离一 直遇到困难，这是因为钾通道种类多，密度低，又找不到高特异性结合的毒素或 药物，因此无法通过上述途径制备DNA探针，它的分子克隆是经由从基因到 蛋白的途径。这一工作是从果蝇的一种突变型钾通道(shaker钾通道)的研究 取得突破的。Papazian和Tempel等首先利用染色体步移等遗传学方法找到编 码这种通道的基因在染色体上的位置，并选择合适的DNA片断序列制备探针， 于1987年首次从果蝇克隆出钾通道的突变基因，从而开始了钾通道的基因研 究

图 8 钠通道蛋白的纯化 对通道蛋白分子结构的进一步认识是利用了 1973 年 Cohen 等创建的 DNA 重组技术（ DNA recombination technique ）。即通过测定纯化的通道蛋白 肽链的部分氨基酸残基序列，推衍出对应的 DNA 序列，选择部分序列制备通 道蛋白的寡聚核苷酸探针，用于从不同组织来源的 DNA 文库中筛选同源的通 道蛋白基因，再推衍出通道蛋白肽链的氨基酸残基序列（图 9 ）。 1982 年， Noda 等用 DNA 重组技术，首先完成了编码 N 2 - 型乙酰胆碱受体阳离子通道 基因的分子克隆，这是第一个被阐明氨基酸序列的通道蛋白。 1984 年， Noda 等又克隆了编码电压门控钠通道 a 亚基的基因。 1987 年， Tanabe 等利用同 样的方法，完成了兔骨骼肌 L 型钙通道 a 1 亚基基因的克隆。钾通道的分离一 直遇到困难，这是因为钾通道种类多，密度低，又找不到高特异性结合的毒素或 药物，因此无法通过上述途径制备 DNA 探针，它的分子克隆是经由从基因到 蛋白的途径。这一工作是从果蝇的一种突变型钾通道（ shaker 钾通道）的研究 取得突破的。 Papazian 和 Tempel 等首先利用染色体步移等遗传学方法找到编 码这种通道的基因在染色体上的位置，并选择合适的 DNA 片断序列制备探针， 于 1987 年首次从果蝇克隆出钾通道的突变基因，从而开始了钾通道的基因研 究

利用反转求倒 组织 提取总mRN 复制cDNA 将cDNA插入质粒 确认 ↓ ⊙口o7 利用标记的探针箱选含有在选择性限制 通道cDNA的重组克隆 生长的介质中 质粒向细菌转化 增值细菌克隆 ↓ CTACCACAGTAT. Leu-Pro-GIn-Tyr. 甜译eDNA序列 为通道肚链的 分析氨基酸序列 推行肽链的拓朴图 全长氨基酸序列 图9离子通道基因的分子克隆 2离子通道结构一机能关系的研究一一膜片钳与基因突变技术的结合由 于基因技术与膜片钳技术的有机结合，对离子通道的研究已经不再满足于基因的 克隆，而是深入到基因所编码的每一个蛋白质在通道中的具体作用和通道蛋白的 结构·机能关系，从分子的角度阐述通道的生理学特性。例如，利用点突变 (site-directed mutagenesis)技术将钾通道蛋白N端的亮氨酸用谷氨酰胺取 代，或将N端的20个氨基酸残基全部删除，电压门控钾通道的快速率（毫秒 级)失活即被消除（图10），据此提出了钾通道快速率失活(N型失活)的 “球-链”机制(ball and chain theory)。再如NGK2和DRK1是两种生 理特性完全不同的钾通道，用位于NGK2第5和第6跨膜段(S5和S6) 之间的437至461位24个氨基酸残基置换DGK1相应部位的残基，所得嵌 合体通道的孔道特性（单通道电导、与阻断剂结合特性等）与供体NGK2的相 似，而其它特性（激活、失活电压依赖性等）则仍保持DGK1的特征，结果支 持S5和S6间的胞外环，是构成电压门控通道孔道部分的肽段。与上述类似 的研究至今仍在继续

图 9 离子通道基因的分子克隆 2.离子通道结构－机能关系的研究 ―― 膜片钳与基因突变技术的结合 由 于基因技术与膜片钳技术的有机结合，对离子通道的研究已经不再满足于基因的 克隆，而是深入到基因所编码的每一个蛋白质在通道中的具体作用和通道蛋白的 结构 - 机能关系，从分子的角度阐述通道的生理学特性。例如，利用点突 变 （ site - directed mutagenesis ）技术将钾通道蛋白 N 端的亮氨酸用谷氨酰胺取 代，或将 N 端的 20 个氨基酸残基全部删除，电压门控钾通道的快速率（毫秒 级）失活即被消除（图 10 ），据此提出了钾通道快速率失活（ N 型失活）的 “ 球 - 链 ” 机制（ ball and chain theory ）。再如 NGK2 和 DRK1 是两种生 理特性完全不同的钾通道，用位于 NGK2 第 5 和第 6 跨膜段（ S5 和 S6 ） 之间的 437 至 461 位 24 个氨基酸残基置换 DGK1 相应部位的残基，所得嵌 合体通道的孔道特性（单通道电导、与阻断剂结合特性等）与供体 NGK2 的相 似，而其它特性（激活、失活电压依赖性等）则仍保持 DGK1 的特征，结果支 持 S5 和 S6 间的胞外环，是构成电压门控通道孔道部 分的肽段。与上述类似 的研究至今仍在继续