四川大学生命科学学院生物科学基地班：绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达 胡美娟 2013141241164 陈彦立 2013141241169 四川大学生命科学学院 生物科学基地班

& 绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达 胡美娟 2013141241164 陈彦立 2013141241169 四川大学生命科学学院 生物科学基地班

目∥1实验背景 2实验用品及方法个绍 3实验流程 4实验原理 5具体实验步骤 6实验结果预测 参考文献

目 录 1 2 3 4 5 6 实验背景 实验用品及方法介绍 实验流程 实验原理 具体实验步骤 实验结果预测 7 参考文献

实验背景 The Nobel Prize in Chemistry 2008 Osamu shimomura, Martin Chalfie. Roger Y Tsien The nobel prize in Chemistry 2008 Photo U Montan Photo U Montan Photo: U. Montan Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y Tsien Prize share: 1/3 Prize share: 1/3 Prize share: 1/3 The Nobel Prize in Chemistry 2008 was awarded jointly to Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y Tsien for the discovery and development of the green fuorescent protein, GFP". 200810月8日,瑞典皇家科学院宣布,2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁。沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得,他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就

200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。 实验背景

绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发 现并分离得到的一种发光蛋白。 它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构,其中 第6567位氨基酸(丝氨酸-酪氨酸一甘氨酸)形成发光团, 为主要发光的位置。 HO 0g9° COOH 图式2GHP发色团的分子结构

绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962 年从多管水母中发 现并分离得到的一种发光蛋白。 它是由238 个氨基酸构成的“β-桶” 型三维立体结构, 其中 第 65 ~ 67 位氨基酸( 丝氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸) 形成发光团, 为主要发光的位置

GFP的演化 通过生物化学的方法将基因做小小的改变,就可以改变GFP中的氨基 酸,得到变异GFP。 目前应用较多的是GFP的突变体一增强型绿色荧光蛋白(简称EGFP) EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸,从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。 所以,EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调 胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等

GFP的演化 通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基 酸, 得到变异GFP。 目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。 所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等

GFP性质 1、检测方便 2、荧光稳定 3、无毒害 4、具有共用性和通用性 5、易于构建载体 6、可进行活细胞定时定位观察

GFP性质 1、检测方便 2、荧光稳定 3、无毒害 4、具有共用性和通用性 5、易于构建载体 6、可进行活细胞定时定位观察

GFP的应用 (1)研究基因表达的调控元件和蛋白定位。 (2)研究基因表达的时序控制与空间定位。 (3)可用于发育分子机理研究。 (4)筛选药物。 (5)临床检验。 (6)转基因动物和植物的筛选标记

GFP 的应用 (1) 研究基因表达的调控元件和蛋白定位。 (2) 研究基因表达的时序控制与空间定位 。 (3) 可用于发育分子机理研究。 (4) 筛选药物 。 (5) 临床检验。 (6) 转基因动物和植物的筛选标记

干扰素 电泳检测 重组质粒的构建 电泳检测 PcR扩增 感受态细胞的制备 酶切 EGFP目的基因获取 转化 pET28a质粒酶切位点选择 引物设计 筛选及复筛及酶切验证 PcR检测 PTG诱导表达 SDS-PAGE检测目的蛋白 包涵体检测 分离纯化

干扰素 电泳检测 重组质粒的构建 电泳检测 酶切 pET28a质粒酶切位点选择 感受态细胞的制备 转化 筛选及复筛及酶切验证 PCR检测 IPTG诱导表达 SDS-PAGE检测目的蛋白 包涵体检测 分离纯化 PCR扩增 EGFP目的基因获取 引物设计

实验用品及方法介绍 方法介绍 研究绿色荧光蛋白在大肠杄菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入大肠杆菌 体内,通过酶切、PCR及用|PTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得岀结论,重组质粒在大肠杆 菌体内成功诱导表达

实验用品及方法介绍 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆 菌体内成功诱导表达。 方法介绍

实验用品 PEGFP-N3模板、菌株E.co丨iDH5α、E.co丨iBL21、质粒 pET28a、限制性内切酶EcoR丨、HindⅢ、T4DNA连接酶、1 kb dna I adder DNA凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA纯化试剂盒及|PTG PR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及PR合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。 PCR仪、凝胶成像系统、荧光显微镜υYγ-6C电泳槽和电泳仪、高速 式离心机、UV2300紫外可见分光光度计

实验用品 PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。 PCR仪、 凝胶成像系统、荧光显微镜DYY-6C电泳槽和电泳仪、高速台 式离心机、UV2300 紫外可见分光光度计