复旦大学：《仪器分析和物理化学》课程教学资源（实验讲稿）06 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素（主讲：雷杰）

荧光分光光度法测定 一、 实验目的 面粉中的核黄素(B) 二、实验原理和内容讲解 三、F-4500型仪器简介 四、F-4500型仪器的使用方法 复旦大学 五、思考题 化学教学实验中心 雷杰 下一页 1909:42

19:09:42 荧光分光光度法测定 荧光分光光度法测定 荧光分光光度法测定 面粉中的核黄素 面粉中的核黄素 面粉中的核黄素（（VBVB222）） 一、实验目的 二、实验原理和内容讲解 三、F-4500 型仪器简介 四、F-4500 型仪器的使用方法 五、思考题 复旦大学 化学教学实验中心 雷杰

一、实验目的 学习荧光分析法的基本原理。掌握面粉样品的消 化方法，了解分子荧光分光光度计的主要结构及工作 原理，掌握其正确使用方法。学习测绘核黄素的激发 光谱和荧光光谱，了解溶液的H值等对核黄素荧光强 度的影响。 1909:42

19:09:42 一、实验目的 学习荧光分析法的基本原理。掌握面粉样品的消 化方法，了解分子荧光分光光度计的主要结构及工作 原理，掌握其正确使用方法。学习测绘核黄素的激发 光谱和荧光光谱，了解溶液的pH值等对核黄素荧光强 度的影响

二、实验原理和内容讲解 。授课对象：化学系三年级本科生，每次四人。 ·教学手段：讨论、提问。 ·同学生一起回顾本学期做过的其他仪分实验，类 比、过渡到本次实验； 重点类比紫外-可见分光光度法（普化实验涉及、本 学期会再做到)，以实验名称中的关键词“分 子”、“荧光”、“面粉”、“核黄素”等为主 线，提问实验原理、步骤等。 19:09:42

19:09:42 二、实验原理和内容讲解 实验原理和内容讲解 实验原理和内容讲解 z 授课对象：化学系三年级本科生，每次四人。 z 教学手段：讨论、提问。 • 同学生一起回顾本学期做过的其他仪分实验，类 比、过渡到本次实验； • 重点类比紫外-可见分光光度法(普化实验涉及、本 学期会再做到)，以实验名称中的关键词“分 子”、“荧光”、“面粉”、“核黄素”等为主 线，提问实验原理、步骤等

原理讲解方案一、类比、讨论 ·试比较分子荧光和紫外-可见分光光度法。 1.从结构化学角度 激发、去活化；吸收、发射；分子、原子。 2.从仪器构造的角度 光源、单色器、监测器、样品池等。 3.比较两种方法的优缺点 灵敏度、选择性、使用范围等 4.专业术语（基本概念)方面 入射光、透射光；激发光（谱）、荧光（光谱）、三维等。 19:09:42

19:09:42 z 试比较分子荧光和紫外-可见分光光度法。 1. 从结构化学角度 激发、去活化；吸收、发射；分子、原子。 2. 从仪器构造的角度 光源、单色器、监测器、样品池等。 3. 比较两种方法的优缺点 灵敏度、选择性、使用范围等 4. 专业术语（基本概念）方面 入射光、透射光；激发光（谱）、荧光（光谱）、三维等。 原理讲解方案一、类比、讨论 原理讲解方案一、类比、讨论 原理讲解方案一、类比、讨论

原理讲解方案二、提问、讨论 1.分子光谱和原子光谱的最主要区别及成因？ 吸收光谱、发生光谱：带状、线状；分子荧光、原子荧光。 2.荧光产生的机制？ 吸收辐射、再发射；振动弛豫、荧光发射、内部转换、体系间跨越、磷光发射等 4.荧光有无方向性？ 固体样品如何测量？样品池如何设计？ 3.关于分子荧光光度法的一些基本概念 激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱 19:09:42

19:09:42 1.分子光谱和原子光谱的最主要区别及成因？ 吸收光谱、发生光谱；带状、线状；分子荧光、原子荧光。 2.荧光产生的机制？ 吸收辐射、再发射；振动弛豫、荧光发射、内部转换、体系间跨越、磷光发射等 4.荧光有无方向性？ 固体样品如何测量？样品池如何设计？ 3.关于分子荧光光度法的一些基本概念 激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱 原理讲解方案二、提问、讨论 原理讲解方案二、提问、讨论 原理讲解方案二、提问、讨论

400 3.12 380 50305 340 荧光相对强度 300 362 1.0 280 0.5 031 0.0 260 300 350 400 450 500 320 340 360 380400 420440 460 em,nm em,m ● 三维荧光光谱示意图： 用途？ 19:09:42

19:09:42 z 三维荧光光谱示意图： 用途？

关于待测样品面粉及核黄素 面粉的主要成分？ 淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等 ● 核黄素 结构、发荧光机制、稳定性、生理作用等 OHOHOH CH2-CH-CH-CH-CH2OH +2H NH -2H ● 氧化型 还原型 首 a 19:09:42

19:09:42 z 面粉的主要成分？ 淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等 z 核黄素 结构、发荧光机制、稳定性、生理作用等 N N NH H3C N H3C O O CH2 CH OH CH OH CH OH CH2OH 关于待测样品面粉及核黄素 关于待测样品面粉及核黄素 关于待测样品面粉及核黄素 氧化型 还原型 +2 H -2 H

具体实验注意事项： ● 溶液配制：防止浪费or不够 ·浓盐酸的浓度 ●用NaOH调节pH值，理论计算？ 配制好的核黄素样品的保存 1909:42

19:09:42 z 溶液配制：防止浪费or不够 z 浓盐酸的浓度 z 用NaOH调节pH值，理论计算？ z 配制好的核黄素样品的保存 具体实验注意事项： 具体实验注意事项： 具体实验注意事项：

三、仪器简介 F-4500型荧光分光光度计： 样品槽： F-4500 比色皿： ? 19:0942

19:09:42 三、仪器简介 F-4500型荧光分光光度计： 比色皿： ？ 样品槽：

F-4500型荧光分光光度计光路图： 激发单色器 S2回 光栅 M 发射单色器 参考光束 光栅 检测器 S 透镜 分束器 光闸 奥S 氙灯 试样油 荧光检测器 试样室光闸 F-4500型荧光分光光度计光路图（日立公司） 图中M为反射镜，S为狭缝 19:09:42

19:09:42 F-4500型荧光分光光度计光路图：