《植物生物学》课程教学资源（实验指导）实验六 叶绿体色素的提取分离及理化性质

6叶绿体色素的提取分离及理化性质 叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，叶绿体色素是植物吸收光能， 进行光合作用的重要物质，主要含有叶绿素（叶绿素，叶绿素b)、类胡萝卜 素（胡萝卜素和叶黄素）等光合色素，这些色素具有不同的化学组成、结构及 理化性质， 在光合作用中执行不同的功能。 实验目的 1.掌握叶绿体色素提取和分离的方法及其原理。 2.了解叶绿体色素的物理化学性质。 实验材料与用品 L.新鲜材料：菠菜(Spinacia oleracea)等植物叶片。 2.实验用品：天平，研钵，剪刀，试剂瓶，漏斗，底、盖直径相同的培养皿，平底短 玻管，分光镜，色层分析滤纸，刻度试管，试管架，玻棒，滴管，烧杯、酒精灯，石棉网等。 3.试剂：石英，95% 醇，碳酸钙，推动洲石油：丙酮：苯的体积比为10：2：)，20% KOH-甲醇溶液(20克KOH溶于100m1甲醇中)，S%的稀盐酸，蒸馏水，醋酸铜结晶，醋酸 -醋酸铜溶液（取醋酸铜15克溶于100ml冰醋酸中，蒸馏水定容至1000ml)等。 实验原理、内容与方法 1.叶绿体色素的提取 叶绿体中含有叶绿素和类胡萝卜素两大类色素，它们与类囊体膜蛋白质结合形成色素蛋 白复合体。叶绿体色素不溶于水，而溶于有机溶剂叶绿素以亲水部分与蛋白质结合，亲脂部 分与类脂结合，纯的有机落剂不能打破色素与蛋白质的结合，所以必须用能与水混溶的乙醇 万丽等有机溶剂，在少量水存在的情况下把叶绿体色素提取出来。 了将新鲜叶片称取5克，洗净擦干，剪去叶柄、中脉后剪碎放入研钵内，加入少量石英 砂和碳酸钙：加入5毫升95%的乙醇迅速研磨成匀浆，再加入10-15毫升95%乙醇，过滤于 棕色试剂瓶中，滤液为叶绿体色素粗提液，避光保存备用。 2.叶绿体色素的分离 分离色素的方法很多，其中纸层析法简便易行。因吸附剂对不同物质的吸附能力不同 当用适当的溶剂推动时，色素混合物随同溶剂在层析滤纸上流过，不同色素在两相（固定相 和流动相)间的分配系数不同，所以移动速度不同，经过一段时间层析后，使不同色素得以 分离。 取一张色层分析用滤纸，在中心打一个圆形小孔，另取一张5-10cm长，1.5-3cm宽

6 叶绿体色素的提取分离及理化性质 叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，叶绿体色素是植物吸收光能， 进行光合作用的重要物质，主要含有叶绿素（叶绿素 a，叶绿素 b）、类胡萝卜 素（胡萝卜素和叶黄素）等光合色素，这些色素具有不同的化学组成、结构及 理化性质，在光合作用中执行不同的功能。 实验目的 1. 掌握叶绿体色素提取和分离的方法及其原理。 2. 了解叶绿体色素的物理化学性质。 实验材料与用品 1．新鲜材料：菠菜（Spinacia oleracea）等植物叶片。 2．实验用品：天平，研钵，剪刀，试剂瓶，漏斗，底、盖直径相同的培养皿，平底短 玻管，分光镜，色层分析滤纸，刻度试管，试管架，玻棒，滴管，烧杯、酒精灯，石棉网等。 3．试剂：石英砂, 95%乙醇, 碳酸钙, 推动剂(石油醚:丙酮:苯的体积比为 10:2:1), 20％ KOH-甲醇溶液(20 克 KOH 溶于 100 ml 甲醇中), 5%的稀盐酸, 蒸馏水, 醋酸铜结晶, 醋酸 -醋酸铜溶液(取醋酸铜 15 克溶于 100ml 冰醋酸中，蒸馏水定容至 1000ml)等。 实验原理、内容与方法 1．叶绿体色素的提取 叶绿体中含有叶绿素和类胡萝卜素两大类色素，它们与类囊体膜蛋白质结合形成色素蛋 白复合体。叶绿体色素不溶于水，而溶于有机溶剂叶绿素以亲水部分与蛋白质结合，亲脂部 分与类脂结合，纯的有机溶剂不能打破色素与蛋白质的结合，所以必须用能与水混溶的乙醇、 丙酮等有机溶剂，在少量水存在的情况下把叶绿体色素提取出来。 ) 将新鲜叶片称取 5 克，洗净擦干，剪去叶柄、中脉后剪碎放入研钵内，加入少量石英 砂和碳酸钙；加入 5 毫升 95%的乙醇迅速研磨成匀浆，再加入 10-15 毫升 95%乙醇，过滤于 棕色试剂瓶中，滤液为叶绿体色素粗提液，避光保存备用。 2．叶绿体色素的分离 分离色素的方法很多，其中纸层析法简便易行。因吸附剂对不同物质的吸附能力不同， 当用适当的溶剂推动时，色素混合物随同溶剂在层析滤纸上流过，不同色素在两相（固定相 和流动相）间的分配系数不同，所以移动速度不同，经过一段时间层析后，使不同色素得以 分离。 ) 取一张色层分析用滤纸，在中心打一个圆形小孔，另取一张 5-10cm 长，1.5-3cm 宽

的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度 限制在0.5cm以内)，风干，重复4-5次，风干后沿长度方向卷成纸捻，将纸捻的点样端插 入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤纸平齐。取一 个培养皿（直径略小于滤纸 中央放 短玻管，管内放1/3-12的推动剂，将插有滤纸的纸捻下端插入盛有推动剂的短玻管中 迅速盖上相同直径的培养皿盖，放于弱光下或暗处，纸捻籍毛细管作用吸收溶剂，溶于溶剂 中的色素随之向四周扩散，不久在滤纸上得到各种色素的同心圆环：叶绿素a为蓝绿色，叶 绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝人素为橙黄色。在滤纸上标出色素环的名称。 问题与思考 (1)研磨叶片提收叶绿体色素时，加入少量碳酸钙有何作用？多加可能出现什么问题？ (2)实验中用纸层析法分离色素时，应注意哪些操作事项？ 3.荧光现象 叶绿体色素分子吸收光量子后，分子内的电子跃迁而变为激发态，因激发能未被话当的 受体接受，被激发的电子又迅速回复到原来的能量水平，释放的能量除一部分转变为热能外 常释放出比原来吸收光的波长更长的荧光或磷光，因此可观察到叶绿体色素提取液的反射光 为暗红色，这种现象称为荧光现象。 矿广取叶绿体色素提取液4毫升置于10毫升试管中（如果太浓可加少量95%乙醇进行稀 释)，在直射光下，分别对着光源、背着光源观察叶绿体色素提取液的颜色。 4.叶绿素的皂化作用 叶绿素是一种双羧酸的酯类物质，能与碱发生皂化反应而生成叶绿酸的盐，形成盐后， 其亲水性大大加强，可溶于水中，用这一方法可将叶绿素和类胡萝卜素分开。 矿取观察过荧光现象的4毫升叶绿体色素提取液，加入1毫升20%KOH-甲醇溶液， 充分摇匀。静置片刻，再加入5毫升苯，混匀后，用滴管沿试管壁慢慢加入1毫升蒸馏水 静置，可见溶液慢慢分为三层，上层是养溶液，其中溶有胡萝卜素及叶黄素：下层是乙醇泽 液，其中溶有己皂化的叶绿素a、b及少量叶黄素。试管底部同时出现白色沉淀（这是细胞 蛋白质产生的乳化现象)。另取4毫升叶绿体色素提取液，直接加入5毫升苯和1毫升蒸馏 水，结果如何？ 5.叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱 叶绿素和类胡萝卜素具有不同的光学特性，它们的吸收光谱可用分光镜检查或用分光光 度计精确测定，叶绿素吸收红光和兰紫光，类胡萝卜素吸收兰紫光

的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度 限制在 0.5cm 以内），风干，重复 4-5 次，风干后沿长度方向卷成纸捻，将纸捻的点样端插 入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤纸平齐。取一个培养皿（直径略小于滤纸），中央放 一短玻管，管内放 1/3-1/2 的推动剂，将插有滤纸的纸捻下端插入盛有推动剂的短玻管中， 迅速盖上相同直径的培养皿盖，放于弱光下或暗处，纸捻籍毛细管作用吸收溶剂，溶于溶剂 中的色素随之向四周扩散，不久在滤纸上得到各种色素的同心圆环：叶绿素 a 为蓝绿色，叶 绿素 b 为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。在滤纸上标出色素环的名称。 #问题与思考 （1）研磨叶片提取叶绿体色素时，加入少量碳酸钙有何作用？多加可能出现什么问题？ （2）实验中用纸层析法分离色素时，应注意哪些操作事项？ 3. 荧光现象 叶绿体色素分子吸收光量子后，分子内的电子跃迁而变为激发态，因激发能未被适当的 受体接受，被激发的电子又迅速回复到原来的能量水平，释放的能量除一部分转变为热能外， 常释放出比原来吸收光的波长更长的荧光或磷光，因此可观察到叶绿体色素提取液的反射光 为暗红色，这种现象称为荧光现象。 ) 取叶绿体色素提取液 4 毫升置于 10 毫升试管中（如果太浓可加少量 95％乙醇进行稀 释），在直射光下，分别对着光源、背着光源观察叶绿体色素提取液的颜色。 4. 叶绿素的皂化作用 叶绿素是一种双羧酸的酯类物质，能与碱发生皂化反应而生成叶绿酸的盐，形成盐后， 其亲水性大大加强，可溶于水中，用这一方法可将叶绿素和类胡萝卜素分开。 ) 取观察过荧光现象的 4 毫升叶绿体色素提取液，加入 1 毫升 20％KOH-甲醇溶液， 充分摇匀。静置片刻，再加入 5 毫升苯，混匀后，用滴管沿试管壁慢慢加入 1 毫升蒸馏水， 静置，可见溶液慢慢分为三层，上层是苯溶液，其中溶有胡萝卜素及叶黄素；下层是乙醇溶 液，其中溶有已皂化的叶绿素 a、b 及少量叶黄素。试管底部同时出现白色沉淀（这是细胞 蛋白质产生的乳化现象）。另取 4 毫升叶绿体色素提取液，直接加入 5 毫升苯和 1 毫升蒸馏 水，结果如何？ 5. 叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱 叶绿素和类胡萝卜素具有不同的光学特性，它们的吸收光谱可用分光镜检查或用分光光 度计精确测定，叶绿素吸收红光和兰紫光，类胡萝卜素吸收兰紫光

了调节分光镜，清断地观察到光源的连续光谱后，将上述经皂化作用已分层的溶液分别 对准通光孔，观察叶绿素和类胡萝卜素提取液的吸收光谱。将观察所得到结果用铅笔绘图表 6.氢和铜对叶绿素中镁的代替作用 叶绿素分子具有卟啉环，镁离子位于卟啉环的中央。叶绿素分子较不稳定，遇酸后，卟 啉环中央的镁易被氢取代，成为褐色去镁叶绿素，在有其它重金属离子存在时，氢又易被其 它重金属元素取代，去镁叶绿素 玛铜成为铜代叶绿素，铜代叶绿素稳定，在光下不易被破坏， 所以用这一方法可制作绿色多汁植物的浸制标本。 了取5毫升叶绿素提取液置于10毫升试管中，加入数滴5%的稀盐酸，慢慢摇动可见溶 液逐渐由绿色变为祸色，叶绿素中的镁被盐酸中的氢取代，形成了去镁叶绿素。 加入少许醋酸铜结晶，缓慢加热，这时去镁叶绿素中的氢叉 取一个200ml烧杯，倒入醋酸-醋酸铜溶液100ml,放入新鲜叶片数片，用酒精灯慢慢 加热，随时观察叶片颜色的变化。 s问题与思考 (1)解释叶绿体色素产生荧光现象的原因，透射光与反射光各呈何种颜色？为什么？ (2)叶绿体色素遇碱后会发生何现象？解释原因 (3)叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱有何不同，绘图说明

) 调节分光镜，清晰地观察到光源的连续光谱后，将上述经皂化作用已分层的溶液分别 对准通光孔，观察叶绿素和类胡萝卜素提取液的吸收光谱。将观察所得到结果用铅笔绘图表 示。 6. 氢和铜对叶绿素中镁的代替作用 叶绿素分子具有卟啉环，镁离子位于卟啉环的中央。叶绿素分子较不稳定，遇酸后，卟 啉环中央的镁易被氢取代，成为褐色去镁叶绿素，在有其它重金属离子存在时，氢又易被其 它重金属元素取代，去镁叶绿素遇铜成为铜代叶绿素，铜代叶绿素稳定，在光下不易被破坏， 所以用这一方法可制作绿色多汁植物的浸制标本。 ) 取 5 毫升叶绿素提取液置于 10 毫升试管中，加入数滴 5%的稀盐酸，慢慢摇动可见溶 液逐渐由绿色变为褐色，叶绿素中的镁被盐酸中的氢取代，形成了去镁叶绿素。 取一半去镁叶绿素溶液，加入少许醋酸铜结晶，缓慢加热，这时去镁叶绿素中的氢又 被铜取代，铜代叶绿素为何种颜色？ 取一个 200ml 烧杯，倒入醋酸-醋酸铜溶液 100ml，放入新鲜叶片数片，用酒精灯慢慢 加热，随时观察叶片颜色的变化。 #问题与思考 （1）解释叶绿体色素产生荧光现象的原因，透射光与反射光各呈何种颜色？为什么？ （2）叶绿体色素遇碱后会发生何现象？解释原因。 （3）叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱有何不同，绘图说明

(4)将新鲜叶片放入醋酸一酷酸铜溶液中，加热过程中叶片颜色会发生哪些变化？为什么？ 若用蒸馏水煮会有何种现象？ (黄淑莉

（4）将新鲜叶片放入醋酸—醋酸铜溶液中，加热过程中叶片颜色会发生哪些变化？为什么？ 若用蒸馏水煮会有何种现象？ (黄淑莉)

实验报告 姓名： 专业： 班级： 组是： 成绩： 实验名称： 1,叶绿体中主要含有哪些色素？依据色素的哪些性质进行提取与分离？纸层析分离后，各 种色素环在滤纸上的位置如何？ 2.叶绿体色素有哪些物理化学性质和光学特性？这些性质有何生理意义？

实验报告 姓名： 专业： 班级： 组号: 成绩： 实验名称： 1.叶绿体中主要含有哪些色素？依据色素的哪些性质进行提取与分离？纸层析分离后，各 种色素环在滤纸上的位置如何？ 2.叶绿体色素有哪些物理化学性质和光学特性？这些性质有何生理意义？