《植物生物学》课程教学资源(实验指导)实验十八 植物化学分类学中层析法的应用

18植物化学分类学中层析法的应用 植物化学分类学(Chemotaxonomy)诞生于20世纪60年代,是一门新兴的 边缘学科,该学科以化学为手段,以分类学为研究的最终目的。植物化学分类 学不仅在分子水平上提供分类学特征,而且还研究物种的系统发育在分子水平 上所反映的规律性。该学科的主要任务为:探索各分类阶元所含化学成分的特 征和生物合成的途径;探索化学成分在植物系统中的分布规律:根据植物中化 合物的特征,进一步研究植物的系统发育。 本实验将以革菜属的两个物种为例,者重介绍植物化学分类学研究的基本方 法 纸层析法和分类学分析方法。 实验目的 1.学习纸层析法的基本原理及操作方法。 2.选择差异明显的实验材料,对其次生代谢产物(如黄酮类)进行层析,并对其结果进 行分类学分析。 实验材料与用品 1.材料 三色(Vola ricolor L.)、早开菜(Viola prionantha Bunge) 2.用品 层析缸或大标本缸15个:毛细管若干:喷雾器:培养皿:层析滤纸:紫外分析灯:扩 展剂:显色剂:预试浸提液:烘箱。 实验内容与方法 1.实验原理 纸层析法是利用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。滤纸是较理想的支持介质,在纸上, 水被吸附在纤维素的纤维间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性,使这部分水不易 扩散,因此与溶 构成两相:固定相(水相)和流动相(有机相 )。当有机流动相沿纸流动 时,层析点上溶质就在水相和有机相间进行分配。随着有机相不断流动,溶质沿着有机相 动的方向移动,且不断分配。溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因此可以彼 此分开。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置通常用尺,值来表 示,R=原点到层析点中心的距腐/原点到溶剂前沿的距离(见图19.1)。一定条件下,某 种物质的R值是常数。R值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层 析温度等因素有关。 2.预准备 2.1试剂 固定相:新华1号滤纸
18 植物化学分类学中层析法的应用 植物化学分类学(Chemotaxonomy)诞生于 20 世纪 60 年代,是一门新兴的 边缘学科,该学科以化学为手段,以分类学为研究的最终目的。植物化学分类 学不仅在分子水平上提供分类学特征,而且还研究物种的系统发育在分子水平 上所反映的规律性。该学科的主要任务为:探索各分类阶元所含化学成分的特 征和生物合成的途径;探索化学成分在植物系统中的分布规律;根据植物中化 合物的特征,进一步研究植物的系统发育。 本实验将以堇菜属的两个物种为例,着重介绍植物化学分类学研究的基本方 法——纸层析法和分类学分析方法。 实验目的 1.学习纸层析法的基本原理及操作方法。 2.选择差异明显的实验材料,对其次生代谢产物(如黄酮类)进行层析,并对其结果进 行分类学分析。 实验材料与用品 1. 材料 三色堇(Viola tricolor L.)、早开堇菜(Viola prionantha Bunge) 2. 用品 层析缸或大标本缸 15 个;毛细管若干;喷雾器;培养皿;层析滤纸;紫外分析灯;扩 展剂;显色剂;预试浸提液;烘箱。 实验内容与方法 1. 实验原理 纸层析法是利用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。滤纸是较理想的支持介质,在纸上, 水被吸附在纤维素的纤维间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性,使这部分水不易 扩散,因此与溶剂构成两相:固定相(水相)和流动相(有机相)。当有机流动相沿纸流动 时,层析点上溶质就在水相和有机相间进行分配。随着有机相不断流动,溶质沿着有机相流 动的方向移动,且不断分配。溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因此可以彼 此分开。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置通常用 Rf 值来表 示,Rf = 原点到层析点中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离(见图 19.1)。一定条件下,某 种物质的 Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层 析温度等因素有关。 2. 预准备 2.1 试剂 固定相:新华 1 号滤纸

流动相:乙酰丙酮:95%乙醇:水=2:2:3 显色剂:2%A1CL乙醇液,用于紫外灯下观察斑点位置和颜色 2,2供试液制备的简单流程 75%乙醇45ml回流提取2次 —→弃去残渣 叶粗粉(0.2g 合并乙醇液 水浴蒸去乙醇,加20ml水 用石油醚萃取2次 ◆水溶液 讨滤 →石油醚 水浴蒸干 加乙醇(95%) +水层 ·残余物 供试液 40ml溶解过滤 溶剂前沿 层析斑点 点样原点 图19.1层析中Rr值(=X/Y)的意义 层析纸
流动相:乙酰丙酮:95%乙醇:水=2﹕2﹕3 显色剂:2%AlCl3 乙醇液,用于紫外灯下观察斑点位置和颜色 2.2 供试液制备的简单流程 图 19.1 层析中 Rf值(=X / Y)的意义 层析纸 75%乙醇 45ml 回流提取 2 次 弃去残渣 叶粗粉(0.2g) 合并乙醇液 水浴蒸去乙醇,加 20ml 水 用石油醚萃取 2 次 水溶液 过滤 石油醚层 水浴蒸干 加乙醇(95%) 水层 残余物 供试液 40ml 溶解过滤 X Y 层析斑点 溶剂前沿 点样原点

层析纸 平衡液 将滤纸卷成筒状 图19.2层析装置示意图 3.实验步骤与方法 3.1物种归属及特征 三色莖和早开堇菜均为基菜属(oaL)植物,但属于不同的亚属和组。前者为美丽 ae),后者为茁菜亚屈(Subg 较进化 美革菜亚属植物的柱头呈球状,近基部两侧有柔毛:柱头孔下方具熊片状突起物:托 叶大,羽状或掌状分裂。革菜亚属植物的柱头不呈头状,前方具喙,喙端具柱头孔。 两者的形态区别见实验五,本实验将从其叶片所含的黄酮类物质方面探讨两者的区别。 32实验步骤与方法 矿将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中(见图192。 取长22cm,宽14cm的层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2-3cm处用铅笔划一条直线。 在此直线上每间隔2cm作1记号。 点样:用毛细管将供试液分别点在各记号位置处,干后再点一次。每点在纸上扩散的直 径最大不超过3mm。 扩展:用线将滤纸缝成简状,但纸的两缘不能接触。将盛有约20m扩展剂的培养皿迅 速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(见图192)。点样的一端在下,扩展剂 的液面需低于点样线1cm。待溶剂上升15-20cm时,取出滤纸,用铅笔描出溶剂前沿界线, 自然干燥或用吹风机吹干。 显色:用喷雾器均匀喷酒2%A1C乙醇液,后置100℃烘箱中烘烤5分钟,或用热风吹 干,置紫外灯下观察斑点位置和颜色,并用铅笔圈出斑点。 计算R值并比较分析。 仔细对比和观察三色革和早开革菜两个物种的层析图谱,找出它们的共同点和不同点
图 19.2 层析装置示意图 3. 实验步骤与方法 3.1 物种归属及特征 三色堇和早开堇菜均为堇菜属(Viola L.)植物,但属于不同的亚属和组。前者为美丽 堇菜亚属(Subgen. Melanium)的三色堇菜组(Sect. Noverculae),后者为堇菜亚属(Subgen. Viola)的合生托叶组(Sect. Adnatae)。目前,一般认为美丽堇菜亚属较原始,而堇菜亚属 较进化。 美丽堇菜亚属植物的柱头呈球状,近基部两侧有柔毛;柱头孔下方具瓣片状突起物;托 叶大,羽状或掌状分裂。堇菜亚属植物的柱头不呈头状,前方具喙,喙端具柱头孔。 两者的形态区别见实验五,本实验将从其叶片所含的黄酮类物质方面探讨两者的区别。 3.2 实验步骤与方法 ) 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中(见图 19.2)。 取长 22cm,宽 14cm 的层析滤纸一张。在纸的一端距边缘 2-3cm 处用铅笔划一条直线。 在此直线上每间隔 2cm 作 1 记号。 点样:用毛细管将供试液分别点在各记号位置处,干后再点一次。每点在纸上扩散的直 径最大不超过 3mm。 扩展:用线将滤纸缝成筒状,但纸的两缘不能接触。将盛有约 20ml 扩展剂的培养皿迅 速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(见图 19.2)。点样的一端在下,扩展剂 的液面需低于点样线 1cm。待溶剂上升 15-20cm 时,取出滤纸,用铅笔描出溶剂前沿界线, 自然干燥或用吹风机吹干。 显色:用喷雾器均匀喷洒 2%AlCl3乙醇液,后置 100℃烘箱中烘烤 5 分钟,或用热风吹 干,置紫外灯下观察斑点位置和颜色,并用铅笔圈出斑点。 计算 Rf值并比较分析。 仔细对比和观察三色堇和早开堇菜两个物种的层析图谱,找出它们的共同点和不同点。 将滤纸卷成筒状 层析纸 平衡液

00 00000 0 80.088888 00 00 0 0 原点A 图19.3同一属中8个物种层析图(其中A为标准液,其余B-I为8个物种)
图 19.3 同一属中 8 个物种层析图(其中 A 为标准液,其余 B-I 为 8 个物种) 原点 A B C D E F G H I

实验报告 姓名 专业 班级 组号: 成绩: 实验名称: 1.根据以上的实验结果,分析三色基和早开革菜在黄相类物质组成上的异同。 2.将观察和分析后的层析滤纸贴于下面
实验报告 姓名: 专业: 班级: 组号: 成绩: 实验名称: 1.根据以上的实验结果,分析三色堇和早开堇菜在黄酮类物质组成上的异同。 2.将观察和分析后的层析滤纸贴于下面
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