《发酵工程》课程教学课件（PPT讲稿）实验4 糖化酶的发酵、提取及酶活测定

心少东理子大 实验4 糖化酶发酵、提取 及活力测定 王丽娟 2017.05

实验4 糖化酶发酵、提取 及活力测定 王丽娟 2017. 05 1

1、实验目的 G中求罪)大等 、了解黑曲霉生长特性，学习糖化酶发酵工艺 •学习酒精沉淀法提取酶制剂的原理，掌握酒精沉淀法提取 糖化酶的方法 ·学习并掌握糖化酶活力测定方法

1、实验目的 2 • 了解黑曲霉生长特性，学习糖化酶发酵工艺 • 学习酒精沉淀法提取酶制剂的原理，掌握酒精沉淀法提取 糖化酶的方法 • 学习并掌握糖化酶活力测定方法

2、实验原理 葡萄糖淀粉酶（glucoamylase, EC.3.3.13)系统名为淀粉- α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶，是国内酶制剂中 产量最大的品种。 。 糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开α-1,4键， 也能切开a-1,3键和α-1,6键，生成葡萄糖。 生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉，将活化好的黑曲霉制成 孢子悬浮液，转接到三角瓶直接进行发酵，或转接到三角 瓶作为种子，进行一次扩大培养后，再转接到发酵罐进行 糖化酶发酵 3

2、实验原理 3 • 葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC.3.3.13）系统名为淀粉- α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶，是国内酶制剂中 产量最大的品种。 • 糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开α-1,4键， 也能切开α-1,3键和α-1,6键，生成葡萄糖。 • 生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉，将活化好的黑曲霉制成 孢子悬浮液，转接到三角瓶直接进行发酵，或转接到三角 瓶作为种子，进行一次扩大培养后，再转接到发酵罐进行 糖化酶发酵

2、实验原理 黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。首先采用过滤法将菌体等杂质 除去，继而对滤液进行浓缩，最后用有机溶剂如乙醇将酶沉 淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端 开始，分解α-1,4键，生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有的醛基 能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠，酸化后析出碘，再用 硫代硫酸钠标准溶液标定，计算酶活力。 酶活力定义：1g固体酶粉（或1mL液体酶），于55℃pH4.6 的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶 活力单位，以U/mL(U/g)表示

2、实验原理 4 • 黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。首先采用过滤法将菌体等杂质 除去，继而对滤液进行浓缩，最后用有机溶剂如乙醇将酶沉 淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。 • 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端 开始，分解α-1,4键，生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有的醛基 能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠，酸化后析出碘，再用 硫代硫酸钠标准溶液标定，计算酶活力。 • 酶活力定义：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶），于55℃pH 4.6 的条件下，1 h分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖，即为一个酶 活力单位，以U/mL（U/g）表示

2、实验原理 中求理工大写 5

2、实验原理 5

菌种斜面培养 种子制备 3、实验步骤 配制发酵培养 接种黑曲霉， 28℃振荡 ·糖化酶发酵 基150mL 灭菌 接种量2% 培养 发酵液4000 剩余发酵 加入2倍体积预 4000rpm离心5 pm离心5 液用盐酸 冷的95%乙醇， min,沉淀物 ·糖化酶提取 min,收集上清 调pH3.5 静置10min 即鲜酶泥 留出 1020 干燥数小时后， 放入真空干 燥箱，40℃ 将鲜酶泥转移 mL 得干酶泥，称重 到称量纸上 下真空干燥 酶活力测定

3、实验步骤 6 • 糖化酶发酵 • 糖化酶提取

3、实验步骤 ·待测酶液的制备： 称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓 冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上请液小心倾入容量瓶 中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后 全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力 在100-250U/mL范围内)，摇匀。通过4层纱布过滤，滤 液供测定用。 7

3、实验步骤 7 • 待测酶液的制备： 称取酶粉1-2g，精确至0.0002g，先用少量的乙酸缓 冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上请液小心倾入容量瓶 中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后 全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力 在100-250 U/mL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤 液供测定用

25mL可溶性淀粉 25mL可溶性淀粉 3、实验步骡 5mL缓冲液 +5mL缓冲液 摇匀，于55C水浴 摇匀，于55C水 锅中预热5min 浴锅中预热5mim 甲 加入待测 乙 酶液2mL 色 立即摇可，于55C 立即摇可，于55C 比色管 ·糖化酶活力测定 准确反应30min 准确反应30min 加入5 M NaOH溶液 加入5 M NaOH溶液 0.2mL 0.2mL 摇匀，迅速冷却 摇匀，迅速冷却 补加待测 酶液2ml 吸取5mL至碘量瓶 吸取5mL至碘量瓶

3、实验步骤 8 • 糖化酶活力测定

3、实验步骤 中东翼工大留 吸取5mL至碘量瓶 吸取5mL至碘量瓶 加入碘溶液10mL 加入碘溶液10mL 加入0.1 M NaOH15mL 加入0.1 M NaOH15mL ·糖化酶活力测定 甲 色管 摇匀，密闭于暗处反应 摇匀，密闭于暗处反应 15 min 15 min 色管 加H2SO4溶液2mL 加H2SO4溶液2mL 立即用Na2S2O3滴定至蓝 立即用Na2S2O3滴定 色恰好消失 至蓝色恰好消失

3、实验步骤 9 • 糖化酶活力测定

4、实验结果 G中本理)太军 酶活力计算： U=(A-B)cX90.05X32.2/5X1/2Xn×2=579.9X（A-B)cXn 式中U-一样品的酶活力，u/mL或u/g A一一空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL; B-一样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL; C-一硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/儿： 90.05一一与1mL硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L)相当的以克表示的葡 萄糖的质量； 32.2-一反应液的总体积，mL; 5一一吸取反应液的体积，mL; 1/2-吸取酶液2ml,换算为1mL: N一一稀释倍数； 2-反应30min,换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数

4、实验结果 酶活力计算： U=（A-B）c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×（A-B）c×n 式中 U——样品的酶活力，u/mL或u/g； A——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL； B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL； C——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L； 90.05——与1 mL硫代硫酸钠标准溶液（1 mol/L）相当的以克表示的葡 萄糖的质量； 32.2——反应液的总体积，mL； 5——吸取反应液的体积，mL； 1/2——吸取酶液2ml，换算为1mL； N——稀释倍数； 2——反应30min，换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数