安徽科技学院：《现代生物工程学》课程教学资源（PPT课件）基因工程——第三章 基因工程的常规技术

第三章基因工程的常规技术 第一节凝胶电泳技术 第二节分子杂交技术 第三节PCR技术 第四节生物芯片 第五节基因文库构建 第六节酵母双杂交系统 第七节DNA测序 1

1 第三章 基因工程的常规技术 第一节 凝胶电泳技术 第二节 分子杂交技术 第三节 PCR技术 第四节 生物芯片 第五节 基因文库构建 第六节 酵母双杂交系统 第七节 DNA测序

第一节凝胶电泳技术 凝胶电泳它是一种分析鉴定重组DNA分子 及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段， 同时也是分子生物学研究方法的技术基础。 ·用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为支 持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。 2

2 第一节 凝胶电泳技术 • 凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子 及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段， 同时也是分子生物学研究方法的技术基础。 • 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为支 持介质的区带电泳法称为凝胶电泳

特点： 1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔 中泳动。 2.电泳操作方法简便，电泳速度快 3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 本节主要介绍琼脂糖凝胶电泳技术。 ● 琼脂糖 半乳糖及其衍生物构成的中性 物质，不带电荷

3 特点： 1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔 中泳动。 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 • 琼脂糖 半乳糖及其衍生物构成的中性 物质，不带电荷 本节主要介绍琼脂糖凝胶电泳技术

HO CH,OH D-半乳糖 3,6-脱水-L-半乳糖 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型 凝胶。 4

4 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型 凝胶。 D-半乳糖 3，6-脱水-L-半乳糖

-45°C ageing 100°C 、100°C sol state initial gel final gel structure Fig.25.Gel structure of agarose.(Laas,T.Doctoral thesis.Acta Universitatis Upsaliensis 1975.Reproduced by kind permission of the Author.) 5

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琼脂糖凝胶的特点 (一)优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的核酸、 病毒等大分子物质。 3.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 4.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量 测定 5.有热可逆性 ⊙

6 琼脂糖凝胶的特点 （一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的核酸、 病毒 等大分子物质。 3.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 4.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量 测定 5.有热可逆性

(二)缺点 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后 必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 7

7 （二）缺点 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后 必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少

琼脂糖凝胶电泳基本原理 在电场的作用下， Power supply (up to 150 V DC) 带有负电荷的DNA或 DNA sample RNA核苷酸链，依靠 well 无反应活性的稳定的 Migration of DNA 介质（琼脂糖凝胶和 聚丙烯酰胺凝胶)和 缓冲液，以一定的迁 Agarose gel 移率从负极移向正极。 Conducting buffer solution 根据核酸分子大小不 -ve electrode +ve electrode 同、构型或形状的差 Fig.3.Agarose gel apparatus 异，可以通过电泳将 DNA分子的迁移速度与其分子质量 其混合物中的不同成 的对数值成反比关系。 分彼此分开。 8

8 DNA分子的迁移速度与其分子质量 的对数值成反比关系。 在电场的作用下， 带有负电荷的DNA或 RNA核苷酸链，依靠 无反应活性的稳定的 介质（琼脂糖凝胶和 聚丙烯酰胺凝胶）和 缓冲液，以一定的迁 移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不 同、构型或形状的差 异，可以通过电泳将 其混合物中的不同成 分彼此分开。 琼脂糖凝胶电泳基本原理

当用EB对DNA 样品染色时，加入的 EB就插入DNA分子 中形成荧光结合物， 荧光的强度与DNA ←780bp 含量成正比，如果用 DNA片段的标准品 作电泳对照，就可以 估计出待测样品的分 子量大小和浓度。 9

9 当用EB 对DNA 样品染色时，加入的 EB就插入DNA分子 中形成荧光结合物， 荧光的强度与DNA 含量成正比，如果用 DNA片段的标准品 作电泳对照，就可以 估计出待测样品的分 子量大小和浓度

DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 仪器 ⊙ 电泳仪、电泳槽、 凝胶成像系统、移液枪； 药品 Agarose、TAE buffer、EB(溴化乙锭) 上样缓冲液(6X) 0.25%溴酚蓝（指示100-200bp的带） 0.25%二甲苯青（指示800-100bp的带） ⑧ 40%蔗糖；水溶液4℃保存。 10

10 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 + - 仪器 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪； 药品 Agarose、 TAE buffer、EB（溴化乙锭） 上样缓冲液（6X） 0.25% 溴酚蓝（指示100-200bp的带）、 0.25%二甲苯青（指示800-100bp的带）、 40%蔗糖；水溶液4℃保存