南京农业大学：动物医学实验课件（PPT讲稿）亚硝酸盐的测定

ICULTURAL亚硝酸盐的测定刘云欢副教授

1 亚硝酸盐的测定 刘云欢 副教授

实验目的和要求了解亚硝酸盐及其毒理理解亚硝酸盐检测的原理掌握亚硝酸盐测定的注意事项及临床意义

实验目的和要求 ◼ 了解亚硝酸盐及其毒理 ◼ 理解亚硝酸盐检测的原理 ◼ 掌握亚硝酸盐测定的注意事项及临床意义 2

器材与试剂器材：小型粉碎机，分析天平（感量0.0001g），恒温水浴锅，721型分光光度计，容量瓶（50mL棕色瓶、100mL、150mL、500mL），烧杯（100mL、200 mL、500 mL），量桶（100 mL、200 mL、1000MI），25mL带塞比色管，试管，移液管等

器材与试剂 ◼ 器材： 小型粉碎机，分析天平（感量0.0001g），恒 温水浴锅，721型分光光度计，容量瓶（50 mL棕色 瓶、100 mL、150mL、500 mL），烧杯（100 mL、 200 mL、500 mL），量桶 （100 mL、200 mL、 1000 Ml），25 mL带塞比色管，试管，移液管等

器材与试剂试剂■氯化铵缓冲液：1L容量瓶中加入500mL水，准确加入20.0mL盐酸，振荡混匀，准确加入50mL氢氧化铵，用水稀释至刻度。必要时用稀盐酸和稀氢氧化铵调试至pH9.6~9.7。硫酸锌溶液（0.42mol/L）：称取120g硫酸锌（ZnS04°7H2O），用水溶解，并稀释至1000mL。氢氧化钠溶液（20g/L）：称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1L.对氨基苯磺酸溶液：称取10g对氨基苯磺酸，溶于700mL水和300mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存

器材与试剂 ◼ 试剂 ◼ 氯化铵缓冲液 ：1 L容量瓶中加入500 mL水，准确加入20.0 mL盐 酸，振荡混匀，准确加入50mL氢氧化铵，用水稀释至刻度。必要 时用稀盐酸和稀氢氧化铵调试至pH 9.6～9.7。 ◼ 硫酸锌溶液（0.42 mol/L） ：称取120 g硫酸锌（ZnSO4·7H2O）， 用水溶解，并稀释至1000 mL。 ◼ 氢氧化钠溶液（20 g/L） ：称取20 g氢氧化钠用水溶解，稀释至1 L。 ◼ 对氨基苯磺酸溶液：称取10 g对氨基苯磺酸，溶于700mL水和 300mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存

器材与试剂■试剂■N一1一基乙二胺溶液（1g/L）称取0.1gN一1一基乙二胺，加60%乙酸溶解并稀释至100mL，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。显色剂：临用前将N一1一萘基乙二胺溶液(1g/L)和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。亚硝酸钠标准溶液：准确称取250.0mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加100mL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。此溶液每毫升相当于500μg的亚硝酸钠。亚硝酸钠标准应用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0μg亚硝酸钠

器材与试剂 ◼ 试剂 ◼ N－1－萘基乙二胺溶液(1 g/L) 称取0.1 gN－1－萘基乙二胺，加 60％乙酸溶解并稀释至100 mL，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中 保存，一周内稳定。 ◼ 显色剂 ： 临用前将N－1－萘基乙二胺溶液(1 g/L)和对氨基苯磺酸 溶液等体积混合。 ◼ 亚硝酸钠标准溶液：准确称取250.0 mg于硅胶干燥器中干燥24 h 的亚硝酸钠，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加100 mL氯化铵缓 冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4 ℃避光保存。此溶液每毫升相 当于500 μg的亚硝酸钠。 ◼ 亚硝酸钠标准应用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.00 mL， 置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于 5.0μg亚硝酸钠

操作■样品处理：■采集至少2kg具有代表性的饲料样品，四分法缩分至约250g，磨碎，过1mm孔筛，混匀，装入密闭容器，防止试样变质，低温保存备用。■称取约10.00g粮食取5g)经绞碎混匀的样品，置于打碎机中，加70mL水和12mL氢氧化钠溶液(20g/L)，混匀，用氢氧化钠溶液(20g/L)调样品pH=8，定量转移至200mL容量瓶中加10mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2～5mL氢氧化钠，混匀。置60℃水浴中加热10min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5h，用滤纸过滤，弃去初滤液20mL，收集滤液备用

操作 ◼ 样品处理： ◼ 采集至少2 kg具有代表性的饲料样品，四分法缩分至约 250 g，磨碎，过1 mm孔筛，混匀，装入密闭容器， 防止试样变质，低温保存备用。 ◼ 称取约10.00 g(粮食取5 g)经绞碎混匀的样品，置于打 碎机中，加70mL水和12 mL氢氧化钠溶液(20g/L)， 混匀，用氢氧化钠溶液(20g/L)调样品pH=8，定量转 移至200 mL容量瓶中加10 mL硫酸锌溶液，混匀，如 不产生白色沉淀，再补加2～5mL氢氧化钠，混匀。置 60 ℃水浴中加热10 min，取出后冷至室温，加水至刻 度，混匀。放置0.5 h，用滤纸过滤，弃去初滤液20 mL ，收集滤液备用

操作■测定：1）亚硝酸盐标准曲线的制备吸取0，0.5，1.0，2.03.0，4.0，5.0mL亚硝酸钠标准应用液（相当于0，2.5，5，10，15，20，25μg亚硝酸钠)，分别置于25mL带塞比色管中。于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液，加2.5mL60%的乙酸后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min，用1cm比色杯(灵敏度低时可换2cm比色杯），以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线。如果测量低含量的溶液时，应制备低含量标准曲线

操作 ◼ 测定： 1）亚硝酸盐标准曲线的制备 吸取0，0.5，1.0，2.0， 3.0，4.0，5.0 mL亚硝酸钠标准应用液(相当于0，2.5 ，5，10，15，20，25μg亚硝酸钠)，分别置于25 mL 带塞比色管中。于标准管中分别加入4.5 mL氯化铵缓冲 液，加2.5 mL60%的乙酸后立即加入5.0 mL显色剂， 加水至刻度，混匀，在暗处静置25 min，用1cm比色杯 (灵敏度低时可换2 cm比色杯)，以零管调节零点，于波 长550 nm处测吸光度，绘制标准曲线。如果测量低含 量的溶液时，应制备低含量标准曲线

操作■测定：2）样品测定吸取10.0mL上述滤液于25mL带塞比色管中，自上述的"于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液"起依法操作。同时做试剂空白对照管

操作 ◼ 测定： 2）样品测定 吸取10.0 mL上述滤液于25 mL带塞比色管 中，自上述的“于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液 ”起依法操作。同时做试剂空白对照管

操作■计算方法：mzX1000X,-VX 1 000m,X式中：Xi一一样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg;m1—一样品质量，g;-测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg;m2—Vi-一样品处理液总体积，mL；V2-一测定用样液体积，mL

操作 ◼ 计算方法： 式中：X1——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg； m1——样品质量，g； m2——测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg； V1——样品处理液总体积，mL； V2——测定用样液体积，mL

操作结果表述：报告算术均值的二位有效数；允许差（相对相差≤10%）

操作 ◼ 结果表述：报告算术均值的二位有效数；允许差（相对 相差≤10%）