河南农业大学：《动物微生物学》课程教学资源（实验指导）实验十一 荧光抗体染色法

实验十一荧光抗体染色法 目的要求 1.通过试验，进一步理解荧光抗体染色法的原理。 2.以炭疽英膜荧光抗体染色法为例，掌握荧光抗体染色法的基本操作方法。 操作步骤 原理：免疫球蛋白与荧光素结合后制成的荧光抗体，仍具有与相应抗原结合的抗体特性 又具有在荧光显微镜下易检测的特性，故可做为一种特异性试剂，在特定条件下去浸染标本 若标本中存在着相应的抗原时，抗原可与荧光抗体结合，形成抗原一抗体一荧光素复合物， 在荧光显微镜下观察，即可看到发荧光的抗原形态，表明相应抗原的存在。如果标本中不存 在与该种荧光抗体相应的抗原，茨光抗体就不能被结合，而被水洗掉，在荧光显微镜下就君 不到抗原的形态，从而达到鉴别抗原、诊断疾病的目的 一、直接法 (一)用疑似病尸的脏器（肝、脾、淋巴结等）涂片，自然干燥，火焰固定， (二)用滴管将抗炭疽杆菌荚膜荧光抗体诊断液（用PBS稀释至工作效价）滴加于待 检标本片上，并使之布满整个标本。 (三)将玻片置湿盒中（玻片少时，可用大平皿，玻片多时，可用放有玻片架的有盖塘 瓷盘，容器底部垫以含水纱布或滤纸)放37℃温箱，作用30分钟左右 (四)取出玻片，用pH7.2~7.6PBS冲去多余的荧光抗体，将玻片在大量的PBS中漂 洗15分钟，中间换液一次，再以蒸馏水冲洗除盐。 (五)玻片自然干燥后，放荧光显微镜下，用高倍镜观察，或滴一滴甘油缓冲盐水（中 性无自发荧光的甘油9份，加pH7.4~7.6PBS1份)代替香柏油，用油镜观察。 上、间接法 (一)用疑似病尸的脏器涂片，自然干燥，火焰固定。 (二)用滴管吸取未标记的兔抗炭疽杆菌荚膜血清（事先用PB$稀释10~20倍），滴 加于待检标本片上，并使其布满整个标本。 (三)将玻片置湿盒中，放37C温箱，作用30分钟，取出玻片，用PBS冲洗15分钟， 中间换液两次。 (四)玻片干燥后，滴加羊抗兔gG荧光抗体诊断液（以PBS稀释至工作效价），并使 它布满整个标本。 (五)置湿盒中，放37℃温箱，作用30分钟，取出玻片，用PBS充分漂洗，再以中性 蒸馏水冲洗除盐。 (六)玻片干燥后，放荧光显微镜下观察。 结果判定 用荧光显微镜观察菌体荧光图像，主要以两个指标判定结果：一是菌体的形态特征： 是荧光亮度。疑为炭疽的标本片经用荧光抗体（直接法或间接法）染色后，若标本片上发现 增大的有荚膜的大杆菌，荚膜有明亮的黄绿一亮绿色的荧光，荚膜中央菌体呈暗绿色或不若 色，则判为阳性：若被检病料有不同程度的分解，镜检时见到呈杆状排列的颗粒状荧光，而 体不清，亦有一定的判定意义 但发现无荚膜而发均匀荧光的杆菌，则不能判为炭疽杆菌 因抗炭疽杆菌荚膜血清中含有沉淀素，能与部分其它需氧芽胞杆菌发生交叉反应 初次应用制成的荧光抗体时，应设以下对照： 1.阳性对照用接种炭疽杆菌死亡的小鼠肝脏涂片，用制备的荧光抗体染色，应见到 明显增大的粗大杆菌，荚膜有明亮的黄绿一亮绿色荧光，菌体呈暗绿色，并应将制备的荧光

实验十一 荧光抗体染色法 目的要求 1. 通过试验，进一步理解荧光抗体染色法的原理。 2. 以炭疽荚膜荧光抗体染色法为例，掌握荧光抗体染色法的基本操作方法。 操作步骤 原理：免疫球蛋白与荧光素结合后制成的荧光抗体，仍具有与相应抗原结合的抗体特性， 又具有在荧光显微镜下易检测的特性，故可做为一种特异性试剂，在特定条件下去浸染标本， 若标本中存在着相应的抗原时，抗原可与荧光抗体结合，形成抗原一抗体一荧光素复合物， 在荧光显微镜下观察，即可看到发荧光的抗原形态，表明相应抗原的存在。如果标本中不存 在与该种荧光抗体相应的抗原，荧光抗体就不能被结合，而被水洗掉，在荧光显微镜下就看 不到抗原的形态，从而达到鉴别抗原、诊断疾病的目的。 一、直接法 （一）用疑似病尸的脏器（肝、脾、淋巴结等）涂片,自然干燥，火焰固定。 （二）用滴管将抗炭疽杆菌荚膜荧光抗体诊断液（用 PBS 稀释至工作效价）滴加于待 检标本片上，并使之布满整个标本。 （三）将玻片置湿盒中（玻片少时，可用大平皿，玻片多时，可用放有玻片架的有盖塘 瓷盘，容器底部垫以含水纱布或滤纸），放 37℃温箱，作用 30 分钟左右。 （四）取出玻片，用 pH7.2～7.6PBS 冲去多余的荧光抗体，将玻片在大量的 PBS 中漂 洗 15 分钟，中间换液一次，再以蒸馏水冲洗除盐。 （五）玻片自然干燥后，放荧光显微镜下，用高倍镜观察，或滴一滴甘油缓冲盐水（中 性无自发荧光的甘油 9 份，加 pH7.4～7.6PBS1 份）代替香柏油，用油镜观察。 二、间接法 （一）用疑似病尸的脏器涂片，自然干燥,火焰固定。 （二）用滴管吸取未标记的兔抗炭疽杆菌荚膜血清（事先用 PBS 稀释 10～20 倍），滴 加于待检标本片上，并使其布满整个标本。 （三）将玻片置湿盒中，放 37℃温箱，作用 30 分钟，取出玻片，用 PBS 冲洗 15 分钟， 中间换液两次。 （四）玻片干燥后，滴加羊抗兔 IgG 荧光抗体诊断液（以 PBS 稀释至工作效价），并使 它布满整个标本。 （五）置湿盒中，放 37℃温箱，作用 30 分钟，取出玻片，用 PBS 充分漂洗，再以中性 蒸馏水冲洗除盐。 （六）玻片干燥后，放荧光显微镜下观察。 结果判定 用荧光显微镜观察菌体荧光图像，主要以两个指标判定结果：一是菌体的形态特征：二 是荧光亮度。疑为炭疽的标本片经用荧光抗体（直接法或间接法）染色后，若标本片上发现 增大的有荚膜的大杆菌，荚膜有明亮的黄绿一亮绿色的荧光，荚膜中央菌体呈暗绿色或不着 色，则判为阳性；若被检病料有不同程度的分解，镜检时见到呈杆状排列的颗粒状荧光，而 菌体不清，亦有一定的判定意义；但发现无荚膜而发均匀荧光的杆菌，则不能判为炭疽杆菌， 因抗炭疽杆菌荚膜血清中含有沉淀素，能与部分其它需氧芽胞杆菌发生交叉反应。 初次应用制成的荧光抗体时，应设以下对照： 1．阳性对照 用接种炭疽杆菌死亡的小鼠肝脏涂片，用制备的荧光抗体染色，应见到 明显增大的粗大杆菌，荚膜有明亮的黄绿一亮绿色荧光，菌体呈暗绿色，并应将制备的荧光

抗体用PBS做不同倍数稀释后，分别用以染色，以确定荧光抗体的工作效价（菌体有明亮 的荧光)及非特异性荧光最弱的荧光抗体稀释倍数。如制成的荧光抗体浓度太低，染色后荧 光太弱，可将其浓缩后再 2.类属抗原对照以枯草杆菌或其它类炭疽杆菌的纯培养物涂片，用制备的荧光抗体 染色，应无明亮的特异荧光。 3.阻抑试验将制备的荧光抗体与未标记的同类1gG或血清等量混合后，去染已知含 炭疽杆菌的病料（一步法），或先以未标记的血清处理标本片，作用30分钟后，再加荧光 抗体（二步法）染色，均应无茨光，或呈弱荧光

抗体用 PBS 做不同倍数稀释后，分别用以染色，以确定荧光抗体的工作效价（菌体有明亮 的荧光）及非特异性荧光最弱的荧光抗体稀释倍数。如制成的荧光抗体浓度太低,染色后荧 光太弱，可将其浓缩后再用。 2．类属抗原对照 以枯草杆菌或其它类炭疽杆菌的纯培养物涂片，用制备的荧光抗体 染色，应无明亮的特异荧光。 3．阻抑试验 将制备的荧光抗体与未标记的同类 IgG 或血清等量混合后，去染已知含 炭疽杆菌的病料（一步法）, 或先以未标记的血清处理标本片，作用 30 分钟后，再加荧光 抗体（二步法）染色，均应无荧光，或呈弱荧光