河南农业大学：《动物微生物学》课程教学资源（实验指导）实验十三 主要病原菌的认识（一）

实验十三主要病原菌的认识（一） 目的要求 认识结核分枝杆菌、布氏杆菌、炭疽杆菌、猪丹毒杆菌和多杀性巴氏杆菌的形态染色特 性和培养特性。 操作步骤 、结核分枝杆菌 取 养物抹片（如没有培养物可用卡介苗代替、干燥、火焰固定，用齐一尼氏法作抗 酸染色（方法见实验二）， 干后镜检观察。 (一)形态染色特性 本菌为革兰氏阳性细长或微弯杆菌，牛型比人型短而粗，禽型具 多形性。无芽胞、无荚膜，不能运动，用齐一尼氏法作抗酸染色，镜检，红色细菌为抗酸菌， 其他细菌为兰色 培养特性 本菌营养要求高，生长缓慢，需2一6周才能发育好，在甘油琼脂」 形成干燥颗粒状，乳白色不透明叠起的菌落。 二、布氏杆菌 布氏杆菌的病料最好取新鲜流产胎儿的胃内容物，或用羊水、胎盘的坏死部分，阴道分 泌物等，必要时也可取乳汁和尿进行检验。但乳汁和尿因含水较多，最好先用离心法沉淀， 取其沉淀物进行镜村 分离培养或接种豚鼠 取上述病料涂片（如无病料可用布氏抗原代替），用鉴别染色法者染后再进行镜检观察。 鉴别染色法常用以下两种： (二)科兹洛夫斯基法具体方法依次为：涂片、自然干燥、火焰固定，用2%沙黄（即 番红花红)水溶液加温染色，出现气泡为止（约1.5分钟），充分水洗1~2分钟，再用1% 孔雀绿水溶液染色0.5一1分钟（亦可用美兰液代替孔雀绿），水洗、干燥、镜检。 本菌呈红色 ,其他菌呈绿色（最好40分钟内镜检，经久则红色褪去）。 (二)改良齐一尼氏法具体方法依次为：涂片、干燥、火焰固定，用稀释石炭酸复红 液染色10分钟，水洗，再用0.5%的醋酸处理，不超过30秒钟，充分水洗，用1%美兰轻 度复染20秒钟，水洗、干燥、镜检。 本菌红色、背景为兰色 (三)形态染色特性革兰氏阴性球状或小而短杆菌，多单在，少短链，无运动性，不 形成芽胞和荚膜。用科兹洛夫斯基鉴别染色法，本菌呈红色，其他杂菌呈绿色。 (四)培养特性流产布氏杆菌和绵羊布氏杆菌初代分离需在5~10%C02环境中始能 生长（也可用燃烛法）。在肝汤琼脂上，2小时形成细小湿润、闪光、圆形隆起菌落。 血清肝汤琼脂内做振荡培养，3~6天后布氏杆菌在距表面0.5cm处形成带状生长。 可取病料（血液、水肺液、淋巴结或人工感染小白鼠死亡后的肝）或培养物进行涂 片，待自然干燥，火焰固定后，病料用美兰或瑞特氏染色，培养物用革兰氏染色，干后镜检， 观察。 (一)形态染色特性革兰氏阳性大杆菌。在组织标木（病料制片）中单个存在或呈短 链排列，有荚膜，无芽胞，菌体呈杆状，两端相连处呈竹节状，在人工培养物标本中，细南 呈长链排列，无荚膜，有卵圆的中实 发偏端芽胞 (二)培养特性在普通琼脂上培养24小时，生成灰白色、扁平、毛玻璃样不透明菌 落，边缘不整齐，呈卷发状，明胶穿刺，呈倒立松树状。 四、猪丹毒

实验十三 主要病原菌的认识（一） 目的要求 认识结核分枝杆菌、布氏杆菌、炭疽杆菌、猪丹毒杆菌和多杀性巴氏杆菌的形态染色特 性和培养特性。 操作步骤 一、结核分枝杆菌 取培养物抹片（如没有培养物可用卡介苗代替）、干燥、火焰固定，用齐一尼氏法作抗 酸染色（方法见实验二），干后镜检观察。 （一）形态染色特性 本菌为革兰氏阳性细长或微弯杆菌，牛型比人型短而粗，禽型具 多形性。无芽胞、无荚膜，不能运动，用齐一尼氏法作抗酸染色，镜检，红色细菌为抗酸菌， 其他细菌为兰色。 （二）培养特性 本菌营养要求高，生长缓慢，需 2～6 周才能发育好，在甘油琼脂上 形成干燥颗粒状，乳白色不透明叠起的菌落。 二、布氏杆菌 布氏杆菌的病料最好取新鲜流产胎儿的胃内容物，或用羊水、胎盘的坏死部分，阴道分 泌物等，必要时也可取乳汁和尿进行检验。但乳汁和尿因含水较多，最好先用离心法沉淀， 取其沉淀物进行镜检，分离培养或接种豚鼠。 取上述病料涂片（如无病料可用布氏抗原代替），用鉴别染色法着染后再进行镜检观察。 鉴别染色法常用以下两种： （二）科兹洛夫斯基法 具体方法依次为：涂片、自然干燥、火焰固定，用 2％沙黄（即 番红花红）水溶液加温染色，出现气泡为止（约 1.5 分钟），充分水洗 1～2 分钟，再用 1％ 孔雀绿水溶液染色 0.5～1 分钟（亦可用美兰液代替孔雀绿），水洗、干燥、镜检。 本菌呈红色，其他菌呈绿色（最好 40 分钟内镜检，经久则红色褪去）。 （二）改良齐一尼氏法 具体方法依次为：涂片、干燥、火焰固定，用稀释石炭酸复红 液染色 10 分钟，水洗，再用 0.5％的醋酸处理，不超过 30 秒钟，充分水洗，用 1％美兰轻 度复染 20 秒钟，水洗、干燥、镜检。 本菌呈红色、背景为兰色。 （三）形态染色特性 革兰氏阴性球状或小而短杆菌，多单在，少短链，无运动性，不 形成芽胞和荚膜。用科兹洛夫斯基鉴别染色法，本菌呈红色，其他杂菌呈绿色。 （四）培养特性 流产布氏杆菌和绵羊布氏杆菌初代分离需在 5～10％CO2 环境中始能 生长（也可用燃烛法）。在肝汤琼脂上，72 小时形成细小湿润、闪光、圆形隆起菌落。 血清肝汤琼脂内做振荡培养，3～6 天后布氏杆菌在距表面 0.5cm 处形成带状生长。 三、炭疽杆菌 可取病料（血液、水肿液、脾、淋巴结或人工感染小白鼠死亡后的肝）或培养物进行涂 片，待自然干燥，火焰固定后，病料用美兰或瑞特氏染色，培养物用革兰氏染色，干后镜检， 观察。 （一）形态染色特性 革兰氏阳性大杆菌。在组织标本（病料制片）中单个存在或呈短 链排列，有荚膜，无芽胞，菌体呈杆状，两端相连处呈竹节状，在人工培养物标本中，细菌 呈长链排列，无荚膜，有卵圆的中央或偏端芽胞。 （二）培养特性 在普通琼脂上培养 24 小时，生成灰白色、扁平、毛玻璃样不透明菌 落，边缘不整齐，呈卷发状，明胶穿刺，呈倒立松树状。 四、猪丹毒

病料采集：可疑猪丹毒疹块型取皮肤败血型采取肾、肝、脾、心血、淋巴结和骨髓 检验，在实验中常用本菌培养物（肉汤或固体培养基加生理盐水稀释）注射小白鼠或鸽（在 鹤体内菌形很大)死后取肝、心血涂片，自然干燥后用瑞特氏或美兰染色（方法见实验二）， 待干后，镜检观察。 (一)形态染色特性革兰氏阳性，平直或微弯的细小杆菌，细菌散在或簇集于白细胞 中，在慢性猪丹毒心内膜疣状物上，多呈长丝状，不运动，不形成荚膜和芽胞。 (二)培养特性在血琼脂上24一48小时后生成针尖大露滴样圆形小菌落，菌落无色 透明，周围可形成狭窄的绿色溶血环。在普通琼脂上生长不佳，明胶穿刺不液化，呈试管 状生长。 五、多杀性巴氏杆菌 尽可能采取新鲜病料（心血、肝、脾、淋巴结、骨髓等）制成涂片，在实验中，可用本 菌的肉汤培养物注射小白鼠或鸡，死后，取肝涂片，自然干燥后，再用瑞特氏或碱性美兰染 色，待干后镜检刘 )形态染色特性 革兰氏阴性球杆菌，菌体两端钝圆，常单在，有时成双，组织抹 片用碱性美兰或瑞特氏染色，干后镜检观察，本菌呈典型明显的两极者色。 (二)培养特性血琼脂上生长良好，24小时可形成淡灰色、圆形、光滑湿润、边缘 整齐露珠样小菌落，不溶血

病料采集：可疑猪丹毒疹块型取皮肤,败血型采取肾、肝、脾、心血、淋巴结和骨髓等 检验，在实验中常用本菌培养物（肉汤或固体培养基加生理盐水稀释）注射小白鼠或鸽（在 鸽体内菌形很大）死后取肝、心血涂片，自然干燥后用瑞特氏或美兰染色（方法见实验二）， 待干后，镜检观察。 （一）形态染色特性 革兰氏阳性，平直或微弯的细小杆菌，细菌散在或簇集于白细胞 中，在慢性猪丹毒心内膜疣状物上，多呈长丝状，不运动，不形成荚膜和芽胞。 （二）培养特性 在血琼脂上 24～48 小时后生成针尖大露滴样圆形小菌落，菌落无色 透明，周围可形成狭窄的绿色溶血环。在普通琼脂上生长不佳，明胶穿刺不液化，呈试管刷 状生长。 五、多杀性巴氏杆菌 尽可能采取新鲜病料（心血、肝、脾、淋巴结、骨髓等）制成涂片，在实验中，可用本 菌的肉汤培养物注射小白鼠或鸡，死后，取肝涂片，自然干燥后，再用瑞特氏或碱性美兰染 色，待干后镜检观察。 （一）形态染色特性 革兰氏阴性球杆菌，菌体两端钝圆，常单在，有时成双，组织抹 片用碱性美兰或瑞特氏染色，干后镜检观察，本菌呈典型明显的两极着色。 （二）培养特性 血琼脂上生长良好，24 小时可形成淡灰色、圆形、光滑湿润、边缘 整齐露珠样小菌落，不溶血