河南农业大学：《动物微生物学》课程教学资源（实验指导）实验十二 酶联免疫吸附试验（ELISA）

实验十二酶联免疫吸附试验(ELISA) 目的要求 1掌握ELISA的基本原理 2.熟悉ELISA(间接法)的操作方法 原理在合适的载体上，薛标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原一抗 体免疫复合物：在一定的底物参与下，免疫复合物上的酶催化底物使其水解，氧化或还原成 另一种带色物质，由于在 一定条件下，酶的降解底物和呈现色泽是成正比的，因而可以通过 比色测定，进而计算出参与反应的抗原或抗体的含量 ELISA方法发展很快，每年都有新的创造和改进，EL山ISA类型也很多，但操作方法都大 体相似。本实验以经典的ELISA间接法测定猪旋毛虫抗体为例，说明ELISA的基本操作方 法和原理。 操作步赛 材料准备 )器材聚苯乙烯40孔平底反应板、加样器、滴管、滤纸、微量混合器、酶标分 光光度计等。 (二)试剂 1.包被液(CB,0.05MpH9.6碳酸盐缓冲掖) 2.93g 蒸馏水加至 1000ml 2.稀释液(PBS,0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液) A液(02 NazHPO4溶液) 72ml B液(0.2MNaH,PO.溶液) 28ml 18g 加蒸馏水至 2000ml 注：A液配制：71.64 g NacHPO.4·12H0溶解在1000ml蒸馏水。 B液配制：31.2gNaH2P0:溶解在1000ml蒸馏水 3.洗涤液(PBST,0.05%吐温PBS,PH74) A液(0.2 MNa:HPO) 81.0ml B液(0,2 M NaH:PO4 19.0ml 吐温(Tween-20) 0.5ml NaCl 8.5g 加蒸馏水至 1000ml 该液4℃冰箱保存备用 4.底物溶液（临用时配制，棕色瓶避光保存）。 邻苯二胺 40mg 0.2M NaHzPO4 257ml 2%无水柠檬酸液 203ml 37%H02 015ml 蒸馏水加至 100ml 5.终止液(2MHS04) 用蒸馏水将10.8ml浓硫酸稀释至100ml(注意应是硫酸滴入水中)。 6.酶标抗体兔抗猪IgG辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体或酶标葡萄球菌A蛋白（酶

实验十二 酶联免疫吸附试验（ELISA） 目的要求 1.掌握 ELISA 的基本原理 2.熟悉 ELISA（间接法）的操作方法 原理 在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原—抗 体免疫复合物；在一定的底物参与下，免疫复合物上的酶催化底物使其水解，氧化或还原成 另一种带色物质，由于在一定条件下，酶的降解底物和呈现色泽是成正比的，因而可以通过 比色测定，进而计算出参与反应的抗原或抗体的含量。 ELISA 方法发展很快，每年都有新的创造和改进,ELISA 类型也很多，但操作方法都大 体相似。本实验以经典的 ELISA 间接法测定猪旋毛虫抗体为例，说明 ELISA 的基本操作方 法和原理。 操作步骤 一、材料准备 （一）器材 聚苯乙烯 40 孔平底反应板、加样器、滴管、滤纸、微量混合器、酶标分 光光度计等。 （二）试剂 1. 包被液（CB，0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲掖） Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水加至 1000ml 2. 稀释液（PBS，0.01M pH7.2 磷酸盐缓冲液） A 液（0.2M Na2HPO4 溶液） 72ml B 液（0.2M NaH2PO4 溶液） 28ml NaCl 18g 加蒸馏水至 2000ml 注：A 液配制：71.64g Na2HPO4·12H2O 溶解在 1000ml 蒸馏水。 B 液配制：31.2g NaH2PO4 溶解在 1000ml 蒸馏水 3. 洗涤液（PBST， 0.05％吐温 PBS，PH7.4） A 液（0.2MNa2HPO4） 81.0ml B 液（0.2M NaH2PO4） 19.0ml 吐温（Tween-20） 0.5ml NaCl 8.5g 加蒸馏水至 1000ml 该液 4℃冰箱保存备用。 4. 底物溶液（临用时配制，棕色瓶避光保存）。 邻苯二胺 40mg 0.2M NaH2PO4 25.7ml 2％无水柠檬酸液 29.3ml 37％H2O2 0.15ml 蒸馏水加至 100ml 5. 终止液（2M H2SO4） 用蒸馏水将 10.8ml 浓硫酸稀释至 100ml（注意应是硫酸滴入水中）。 6. 酶标抗体 兔抗猪 IgG 辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体或酶标葡萄球菌 A 蛋白（酶

标SPA),自制或购买。 7.标准抗原 自制或购买」 自制或购买 二、操作步骤 (一)抗原包被抗原用pH96的碳酸盐缓冲液作适当稀释（购买者，按说明书：自制 者，需事先进行滴定)后包被，每孔加200μ山，放湿盒置4℃冰箱过夜 洗涤 女日甩干（甩干洗涤液 下同)用pH7.4PBST洗涤三次，每次3分钟(3 ×3”),每次洗涤时，先将上次洗涤液甩干。 (三)加血清将被检血清作1：80稀释（全血作1：10稀释)，每份血样做两孔，每孔 加100μ1，同时加入1：100阳性血清和1：80阴性血清各两孔作对照，置湿盒放37C温箱作 用30分钟。 (四)洗涤同步骤（二 (五)加酶标抗体（或酶标SPA)甩干，每孔加入酶标抗体（或酶标SPA)1OOμ1 37℃湿盒作用30分钟。 (六)洗涤同步聚（二）。 (七)加底物每孔加底物溶液100μ1,37C湿盒作用30分钟 (八)终止反应每孔加入2MHSO,溶液（终止液）各一滴 九)比色 肉眼或用酶标分光光度计比色。 结果判定 肉眼观察液体里黄色或棕褐色者为阳性反应，无色者为阴性反应。 分光光度计比色选用492m的波长比色，见被检血清OD值高于标准阴性血清平均OD 值二倍以上者为阳性反应，否则为阴性反应

标 SPA），自制或购买。 7. 标准抗原 自制或购买。 8. 标准阴、阳性血清 自制或购买。 9. 检样 采集的猪血清。 二、操作步骤 （一）抗原包被 抗原用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液作适当稀释（购买者，按说明书；自制 者，需事先进行滴定）后包被，每孔加 200μl，放湿盒置 4℃冰箱过夜。 （二）洗涤 次日甩干（甩干洗涤液，下同）用 pH7.4PBST 洗涤三次，每次 3 分钟（3 ×3′），每次洗涤时，先将上次洗涤液甩干。 （三）加血清 将被检血清作 1:80 稀释（全血作 1:10 稀释），每份血样做两孔，每孔 加 100μl，同时加入 1:100 阳性血清和 1:80 阴性血清各两孔作对照，置湿盒放 37℃温箱作 用 30 分钟。 （四）洗涤 同步骤（二）。 （五）加酶标抗体（或酶标 SPA） 甩干，每孔加入酶标抗体（或酶标 SPA）100μl， 37℃湿盒作用 30 分钟。 （六）洗涤 同步骤（二）。 （七）加底物 每孔加底物溶液 100μl，37℃湿盒作用 30 分钟。 （八）终止反应 每孔加入 2MH2SO4 溶液（终止液）各一滴。 （九）比色 肉眼或用酶标分光光度计比色。 结果判定 肉眼观察液体里黄色或棕褐色者为阳性反应,无色者为阴性反应。 分光光度计比色选用 492nm 的波长比色，见被检血清 OD 值高于标准阴性血清平均 OD 值二倍以上者为阳性反应，否则为阴性反应