《细胞生物学》课程教学资源（PPT课件）第二章 细胞生物学的研究方法 research methods for cell biology 第二节 生物化学分析技术（molecular hybridization）

第二节生物化学分析技术六、分子杂交技术(molecularhybridization)DNA变性：当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值（13)条件下，维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏，DNA双链解离成两条单链,这一过程叫DNA变性DNA复性：当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构，这一过程叫DNA复性，又叫DNA杂交

第二节 生物化学分析技术 (molecular hybridization)

DNADenaturation and RenaturationDouble-strandedDNAmolecules1000LHeatDenaturedsingle-strandedDNAmoleculesICool slowlyReannealeddouble-strandedDNAmolecules0

核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。linearplasmidDNAmolecule with cohesive endscircularplasmidDNAmoloculeANNEALTTAACOVALENTRESTRICTIONLINKAGEBYNUCLEASLEINTDNALIGASECLEAVAGEplasmid DNAmoleculecontainingchromosomalDNAinsertAoneofmanyDNAfragmentsproducedbycuttingchromosomalDNAwiththe same restriction nuclease

第二节生物化学分析技术在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行杂交，叫原位杂交（insituhybridization）。可用于DNA、RNA定位研究。原位杂交检测菱缩性胃炎p53mRNA表达

在不破坏细胞或细胞器的情况下， 原位杂交(in situ hybridization)。 第二节 生物化学分析技术 原位杂交检测萎缩性胃炎p53 mRNA表达

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FiSH）：Fluoresence ln Situ HybridizationQQLabelingwithfluorescentdyeDNAorobeDenature&MIXIMXMXHybridizeFISH技术的原理图解

荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH): FISH技术的原理图解

第二节生物化学分析技术芯片DNAchip技术PreparecDNAProbePrepare Microarray"Normal"TumorRT/PCRLabelwithFluorescentDyeoCombineEqualAmountsHybridizenbetomicroarraySCANMicroarrayTechnology

第二节 生物化学分析技术 芯片

第二节生物化学分析技术七、PCR技术多聚酶链反应，polymerasechainreaction)根据双链DNA的变性与复性和分子杂交原理设计出的技术，目的是将极微量DNA大量扩增。原理：将DNA片段经过若干次解链和复性循环，大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知DNA片段进行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析和临床诊断等

根据双链DNA的变性与复性和分子杂交原理设计出 的技术，目的是将极微量DNA大量扩增。 原 理：将DNA片段经过若干次解链和复性循环，大 量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知DNA片 段进行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析和 临床诊断等。 第二节 生物化学分析技术 (多聚酶链反应, polymerase chain reaction)

PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及缓冲液PCR的基本反应步骤：变性：将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性为单链：退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板DNA退火结合；延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍

PCR的反应体系： 模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及缓冲液。 PCR的基本反应步骤： 1. 变性：将反应系统加热至95℃ ，使模板DNA完全变性为单链； 2. 退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升至72℃ ，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的 合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA 扩增达百万倍

95℃模板DNA

PCR的基本原理 ¡ PCR反应条件 ¡ PCR过程 ¡ PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温 度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 D N A 变 性 形 成 2 条 单 链 模板DNA 95℃

50℃引物1DNA引物引物2

PCR的基本原理 ¡ PCR反应条件 ¡ PCR过程 ¡ PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物