厦门大学：《生物化学实验》课程教学资源（讲义）碱性磷酸酶的分离提取

SITAS碱性磷酸酶的分离提取王勤

碱性磷酸酶的分离提取 王勤

S/TAS实验目的1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤2.掌握牡蛎碱性磷酸酶制备的操作技术3.对硝基苯酚标准曲线的制作

1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握牡蛎碱性磷酸酶制备的操作技术 3.对硝基苯酚标准曲线的制作 实验目的

SITAS实验原理

实验原理

蛋白质的分离纯化separationandpurificationITAS材料》鲜度、含量、保存方法组织捣碎法、研磨法、匀浆法、超声破碎法、破碎冻融法等提取缓冲液（pH、温度等）、搅拌、增溶剂、抽提抽提液与抽提物的比例等分离盐析、有机溶剂（乙醇、丙酮等）、等电点沉淀等纯化》离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、亲和层析等酶活力、纯度、分子量分析及鉴定

材料 破碎 抽提 分离 纯化 组织捣碎法、研磨法、匀浆法、超声破碎法、 冻融法等 提取缓冲液（pH、温度等）、搅拌、增溶剂、抽提 液与抽提物的比例等 盐析、有机溶剂（乙醇、丙酮等）、等电点沉淀等 离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、亲和层析等 鲜度、含量、保存方法 蛋白质的分离纯化 separation and purification 分析及鉴定 酶活力、纯度、分子量

盐析Salting-out高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子ITAS从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析OH-HtH+OH-PH>pI.带负电荷在等电点状态的pH<pI，带正电荷，又有水膜，是稳定的又有水膜·是秘定的酶蛋白，水膜未脱，亲水胶体亲水胶体楚不稳定的亲水胶体中性盐中性盐中性垫破坏水膜破坏水膜破坏水膜中性盐中和其电荷中性盐中和其电荷NHt或Na+等SOi-等蛋白质沉淀

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子， 从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶 液中沉淀出来。 各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶 液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。 盐析Salting-out

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易ITAS使蛋白质变性而应用最广。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。Salting-out:llesaiting-ineffeciAmmonium溶解度sulfateSOSodiumsulfateAggregatelonicstrength

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易 使蛋白质变性而应用最广。硫酸铵沉淀法可 用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质

硫酸铵分级沉淀SITAS10080604020020406080Saturation of ammonium sulfate(%)上清液中酶蛋白相对活力与硫酸铵浓度曲线

上清液中酶蛋白相对活力与硫酸铵浓度曲线 硫酸铵分级沉淀

SITAS在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数提纯步骤才有效唯有比活力提高较大

在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定 酶的活力和比活力。酶的比活力定义为每mg蛋 白所具有的酶活力单位数。 唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效

碱性磷酸酶SITAS碱性磷酸酶：Alkaline phosphatase（EC3.1.3.1）简称为ALPase广泛存在于微生物界和动物界广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多，其次为肾脏，骨骼、肠和胎盘等组织

碱性磷酸酶  碱性磷酸酶： Alkaline phosphatase （EC 3.1.3.1） 简称为ALPase  广泛存在于微生物界和动物界  广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏 为最多，其次为肾脏，骨骼、肠和胎盘等组织

碱性磷酸酶（ALP）的功能SITASALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，将对应底物去磷酸化，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。它也可以催化磷酸基团的转移反应，将磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。OH底物底物ALP0-P=0+H20OH +H,P04OH核酸、蛋白、核酸、蛋白、生物碱等生物碱等

碱性磷酸酶（ALP）的功能 底 物 ＋H20 ALP 底 物 ＋H3P04 核酸、蛋白、 生物碱等 核酸、蛋白、 生物碱等 • ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，将 对应底物去磷酸化，产生无机磷酸和相应的醇、酚或 糖。这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，将磷酸基团从磷酸酯转移 到醇、酚或糖等磷酸受体上