华东理工大学：《基因工程》课程教学资源（课件讲稿）第十章 外源基因表达产物的分离纯化（PPT）

10外源基因表达产物的分离纯化 A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 ●针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 ●合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化

A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 10 外源基因表达产物的分离纯化 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化

针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白,通常体积大、浓度低,因此应在 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理; 采用包涵体型战略表达重组蛋白,应先离心回收包涵体; 采用融合型战略表达重组蛋白,一般是胞内可溶性的,拟首先选 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质,应用低浓度的溶 菌酶处理,然后再用渗透压休克法释放重组蛋白

针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白

针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域(pl≤5或pl≥8)的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离,这样很容易除去几乎所有的杂蛋白 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件,原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内(103-104mol/L); 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的; 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的; 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种 复合技术,在流量、负荷量等参数方面显示岀极大的优越性

针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内（10-8 - 10-4 mol / L）； 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种 复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性

多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时,通常需要综合使用多种技术,一般来 说,在选择分离纯化方法时应遵循下列原则: ●应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 ●应首先选择能除去含量最多杂质的方法 ●应尽量选择高效的分离方法 ●应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段

多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来 说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段

合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有 Sephadex和 Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质: 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定,重复性好 价格低廉

合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉

分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程 未必合适,如 实验室方法在工程上可能难以实现(超声波破细胞壁) ●实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心) 因此,在很多情况下,实验室的技术路线不等于生产工艺

分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程 未必合适，如： 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺

10外源基因表达产物的分离纯化 B离子交换层析 离子交换层析的基本原理 ●离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 ●离子交换层析的基本操作

B 离子交换层析 10 外源基因表达产物的分离纯化 离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换层析的基本操作 离子交换介质的选择原则

离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以特定的含离子溶液为 流动相,利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异,而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术

离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术

离子交换介质的基本性质 离子交换剂的基本性能 离子交换剂亦称离子交换介质,通常是一种不溶性高分子化合物 如树脂,纤维素,葡聚糖,醇脂糖等 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳 离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上,则在用洗脱液洗 脱时,各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去 电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同,即亲和力大 小有差异,因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来,达到分离纯化的目的

离子交换介质的基本性质 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物 如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳 离子交换剂的基本性能 离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗 脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去 电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的

离子交换介质的基本性质 离子交换剂的分类 阳离子交换剂:强酸型和弱酸型 可电离的基团 磺酸基(-SO3H) 磷酸基(-PO3H2) 羧酸基(-COOH) 酚羟基(-OH) 阴离子交换剂:强碱型和弱碱型 可电离的基团 伯胺基(-NH 仲胺基(-NHCH3) 叔胺基(-N(CH3)2 季胺基(-N(CH3)3

离子交换介质的基本性质 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型 可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 离子交换剂的分类 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH） 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离的基团 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3 )2） 季胺基（-N+ (CH3 ) 3 ）