华东理工大学：《基因工程》课程教学资源（课件讲稿）第六章 大肠杆菌基因工程（PPT）

生物工程专业核心课程 基因工程 华东理工大学张惠展

生物工程专业核心课程 基 因 工 程 华东理工大学 张惠展

基因工程 1基因工程的基本概念 2基因工程的基本原理 3基因工程所需的基本条件 4基因工程的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6大肠杆菌基因工程 7酵母基因工程 8哺乳动物基因工程 9高等植物基因工程

基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念 基因工程的基本原理 基因工程所需的基本条件 基因工程的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 大肠杆菌基因工程 酵母基因工程 哺乳动物基因工程 高等植物基因工程

6大肠杆菌基因工程 A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 6 大肠杆菌基因工程 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

6大肠杆菌基因工程 A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架 ●基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 6 大肠杆菌基因工程 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

6大肠杆菌基因工程 A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 ●缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 ●细胞周质内含有种类繁多的内毒素

A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 6 大肠杆菌基因工程 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素

6大肠杆菌基因工程 B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 ●密码子 质粒拷贝数

B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 6 大肠杆菌基因工程 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数

启动子 目的基因 启动子最佳距离的探测 目的基因 A酶切开 E 启动子 Ba31酶解

启动子 启动子最佳距离的探测 目的基因 E E A E E 启动子 A 酶切开 Bal31酶解 目的基因

启动子 启动子的筛选 采用鸟枪法战略,将合适大小的DNA片段 终止密码子 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的gaE、ga/7与质 pKo galK 粒上报告基因ga的表达产物联合作用, 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化ga、ga、gaK的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆

启动子 启动子的筛选 Apr ori pKO1 galK 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 终止密码子 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质 粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化galE+ 、galT+ 、galK-的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆

启动子 启动子的构建 启动子 35区序列 -10区序列 GA C A G ATA CT recA TGAT A traA A GT TGA C A lac TTTA A TATA A T tac GAC A AA T tac =3 Pro =11 Plac

启动子 启动子的构建 -35 区序列 -10 区序列 PlL PrecA Ptrp Plac PtraA Ptac 启动子 T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C A T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac

启动子 启动子的可控性 基底水平转录 乳糖启动子Pac的可控性: 阻遏蛋白 野生型的Pa与其控制区Oae 偶联在一起,在没有诱导物 O 存在时,整个操纵子处于基乳糖异丙基β-D-硫 代半乳糖苷(IPTG) 诱导 底水平表达;诱导物可以使 启动子Pa介导的转录大幅 《 高效转录 提高

启动子 启动子的可控性 P 乳糖启动子Plac的可控性： O P O 高效转录 阻遏蛋白 诱导 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 基底水平转录 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高