华东理工大学：《基因工程》课程教学资源（课件讲稿）第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建（PPT）

生物工程专业核心课程 基因工程 华东理工大学张惠展

生物工程专业核心课程 基 因 工 程 华东理工大学 张惠展

基因工程 1基因工程的基本概念 2基因工程的基本原理 3基因工程所需的基本条件 4基因工程的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6大肠杆菌基因工程 7酵母基因工程 8哺乳动物基因工程 9高等植物基因工程

基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念 基因工程的基本原理 基因工程所需的基本条件 基因工程的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 大肠杆菌基因工程 酵母基因工程 哺乳动物基因工程 高等植物基因工程

5目的基因的克隆与基因文库的构建 A鸟枪法 B CDNA法 CPCR法 D化学合成法 E基因文库的构建

5 目的基因的克隆与基因文库的构建 C PCR法 B cDNA法 A 鸟枪法 D 化学合成法 E 基因文库的构建

5目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和 生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌 (细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。 般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另 类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然 后将之克隆表达

5 目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达

5目的基因的克隆与基因文库的构建 A鸟枪法 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性

A 鸟枪法 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段,然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端 全酶切:片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开, 大小不可控 部分酶切:片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整 与载体连接 如果转化子釆用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载 体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体 转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作 受体细胞;如果转化子釆用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）

鸟枪法操作的改进 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA, 然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高 重组子中目的重组子的出现频率

鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA

鸟枪法操作的改进 在连接前将DNA片段进行分级分离 例如,已知某目的基因位于1.8kb的Sal 片段中,将染色体DNA用S切开,琼 脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于 1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块,从此 凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进16618 行拼接

鸟枪法操作的改进 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接 在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb

鸟枪法操作的改进 凝胶DNA片段回收技术 冻融法 滤纸法 ●吸附法 低融点凝胶法 溶解法 二=

鸟枪法操作的改进 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技术