厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）实验九 免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架

免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架 实验九

免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架 实验九

实验目的与要求 1. 掌握免疫荧光技术的基本原理; 2. 了解免疫荧光技术在生命科学中的 广泛应用

实验目的与要求 1. 掌握免疫荧光技术的基本原理; 2. 了解免疫荧光技术在生命科学中的 广泛应用

一、实验的基本原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其 基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激 发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品 结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。 这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免 疫检测方法的基础。 荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或 其组分进行定性、定位、定量观察检测

一、实验的基本原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其 基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激 发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品 结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。 这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免 疫检测方法的基础。 荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或 其组分进行定性、定位、定量观察检测

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三、试剂与器材 人肿瘤细胞涂片 甲醇、H2O2、滤纸、PBS、正常羊血清封闭液、一抗、 FITC标记的IgG、甘油/PBS封片剂、盖玻片 荧光显微镜

三、试剂与器材 人肿瘤细胞涂片 甲醇、H2O2、滤纸、PBS、正常羊血清封闭液、一抗、 FITC标记的IgG、甘油/PBS封片剂、盖玻片 荧光显微镜

玻片细胞置于甲醇中-10℃固定5min，室温凉干（或冷丙酮 固定5min，室温凉干）； PBS漂洗2min×3次； 3% H2O2室温孵育10min（以去除细胞内源性过氧化物酶 活性）； PBS漂洗5min×3次； 10%正常羊血清封闭液（0.1M PBS配制）室温封闭20min； 弃封闭液（此步骤不必PBS洗涤）； 四、实验步骤

玻片细胞置于甲醇中-10℃固定5min，室温凉干（或冷丙酮 固定5min，室温凉干）； PBS漂洗2min×3次； 3% H2O2室温孵育10min（以去除细胞内源性过氧化物酶 活性）； PBS漂洗5min×3次； 10%正常羊血清封闭液（0.1M PBS配制）室温封闭20min； 弃封闭液（此步骤不必PBS洗涤）； 四、实验步骤

用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为1:100-1:200） 37℃孵育1h（或4℃孵育过夜）； PBS漂洗5min×3次； 用适当比例稀释的二抗（FITC标记的IgG）（一般 稀释比为1:100-1:200，用加有BSA的TBS－T配制） 室温孵育30min（避光黑暗条件下进行）； PBS漂洗5min×3次； 甘油/PBS封片剂（PBS: 甘油=1：9，v/v，pH8.0- 8.5）封片； 荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜观察拍照

用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为1:100-1:200） 37℃孵育1h（或4℃孵育过夜）； PBS漂洗5min×3次； 用适当比例稀释的二抗（FITC标记的IgG）（一般 稀释比为1:100-1:200，用加有BSA的TBS－T配制） 室温孵育30min（避光黑暗条件下进行）； PBS漂洗5min×3次； 甘油/PBS封片剂（PBS: 甘油=1：9，v/v，pH8.0- 8.5）封片； 荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜观察拍照

五、注意事项 1. 注意各级抗体浓度的使用范围; 2. 荧光抗体孵育时要注意避光; 3. 注意各步骤的漂洗要充分

五、注意事项 1. 注意各级抗体浓度的使用范围; 2. 荧光抗体孵育时要注意避光; 3. 注意各步骤的漂洗要充分

六、作业与思考题 试述免疫荧光技术的基本原理,并描述 实验中所观察的实验现象. 思考题: 试比较免疫荧光技术与免疫细胞化学 技术的异同

六、作业与思考题 试述免疫荧光技术的基本原理,并描述 实验中所观察的实验现象. 思考题: 试比较免疫荧光技术与免疫细胞化学 技术的异同