《基因工程概论》课程教学资源（PPT课件）质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳（实验）

实验三 质粒DNA的酶切鉴定 及琼脂糖凝胶电泳

实验三 质粒DNA的酶切鉴定 及琼脂糖凝胶电泳

1.实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶 解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法,并 理解限制性内切酶是DNA重组技术的 关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴 定DNA片段的有效方法

1. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶 解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并 理解限制性内切酶是DNA重组技术的 关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴 定DNA片段的有效方法

2.相关基础知识 限制性核酸內切酶:是一类能识别双 链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶。是体外剪切基因片段的重要工 具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶 以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中 重要的工具,而且还可以用于基因组 酶切图谱的鉴定

2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双 链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶。是体外剪切基因片段的重要工 具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶 以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中 重要的工具，而且还可以用于基因组 酶切图谱的鉴定

1)寄主控制的限制与修饰现象 2)核酸限制性内切酶的类型 3)核酸限制性内切酶的基本特性 4)同裂酶和同尾酶 5)核酸限制性内切酶的命名法 6)影响核酸限制性内切酶活性的因素

1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型 3) 核酸限制性内切酶的基本特性 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素

1寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各 种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双 链的核酸内切酶,它们以此来限制外源DNA 存在于自身细胞内,但合成这种酶的细胞自 身的DNA不受影响,因为这种细胞还合成了 种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现 象被称为寄主控制的限制与修饰现象

1) 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各 种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双 链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自 身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了 一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现 象被称为寄主控制的限制与修饰现象

2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同,分为三类: I型 Ⅱ型 Ⅲ型

2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型

第一类(型)限制性內切醢能识别专 的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些 核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切 割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因 工程中用处不大,无法用于分析DNA结构 或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等

第一类（I型）限制性内切酶能识别专一 的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些 核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切 割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因 工程中用处不大，无法用于分析DNA结构 或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等

第二类(型)限制性內切醢能识别专一的核 苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割 双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割 的核苷酸都是专一的。因此,这种限制性内 切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4 个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以 及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文 对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴 朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切 割可以有两种方式:

第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核 苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割 双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割 的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内 切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4 个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以 及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文 对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴 朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切 割可以有两种方式：

粘性末端;是交错切割,结果形成两条单链末端 这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键, 所以称为粘性末端。 如 EcoR的识别顺序为: 53…GA|TT_C…3 C-TTAAG 5 垂直线表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC或 CTTAAG,这就是回文顺序( pal indrome)。和 表示在双链上交错切割的位置,切割后生成5’G和 AATTC.3、3…TA和G5二个DNA片段,各有 个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以 及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合

粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’ 垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和 AATTC……3’ 、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一 个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以 及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”

平头末端: l型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链,产生平头末端。例如 EcoRV 的识别位置是: GAT ATC 3 3.. CTATAG….5 切割后形成5…GAT和ATc 3 3 ●●·。● GTA和TAG 5’。这种末端同 样可以通过DNA连接酶连接起来

II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’ 、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同 样可以通过DNA连接酶连接起来。 平头末端：