《基因工程概论》课程教学资源（PPT课件）第六章 基因工程的基本技术（DNA的分离和检测、聚合酶链式反应、序列分析）

《鷂囚品理论》 第一章导论 第二章基因操作的工具酶 第三章基因克隆的载体 第四章基因克隆的策略 第五章克隆基因的表达 第六章基因工程的基本技术

《基因工程概论》 第一章 导 论 第二章 基因操作的工具酶 第三章 基因克隆的载体 第四章 基因克隆的策略 第五章 克隆基因的表达 第六章 基因工程的基本技术

第六章基因工程的基本技术 第一节DNA的分离和检测 第二节DNA聚合酶链式反应 第三节DNA的序列分析 第四节植物转基因技术

第六章 基因工程的基本技术 第一节 DNA的分离和检测 第二节 DNA聚合酶链式反应 第三节 DNA的序列分析 第四节 植物转基因技术

质粒DNA的小量制备 ①将含有质粒DNA的大肠杆菌接种到LB培养基中(含有相应 抗生素),在37℃下震荡培养过夜,这样质粒DNA便随着 细菌的繁殖而得到了大量的扩增。当细菌培养物生长到对 数晚期时,我们就可获得很高产量的质粒DNA。 ②通过离心收集细菌,用碱性溶液处理使得细菌细胞裂解 释放出其中的质粒DNA分子。在碱性条件下,宿主的线状 染色体DNA发生变性,但是闭环质粒DNA双链由于处于拓 扑缠绕状态而不能彼此分开,所以当条件恢复正常时,质 粒DNA链迅速得到准确复位成为超螺旋分子 ③通过离心去掉细胞碎片、染色体DNA和其它杂质,并将水 相的质粒DNA分子用乙醇沉淀出来,最后溶于TE缓冲液或 纯水中备用

质粒DNA的小量制备 ①将含有质粒DNA的大肠杆菌接种到LB培养基中（含有相应 抗生素），在37℃下震荡培养过夜，这样质粒DNA便随着 细菌的繁殖而得到了大量的扩增。当细菌培养物生长到对 数晚期时，我们就可获得很高产量的质粒DNA。 ②通过离心收集细菌，用碱性溶液处理使得细菌细胞裂解， 释放出其中的质粒DNA分子。在碱性条件下，宿主的线状 染色体DNA发生变性，但是闭环质粒DNA双链由于处于拓 扑缠绕状态而不能彼此分开，所以当条件恢复正常时，质 粒DNA链迅速得到准确复位成为超螺旋分子。 ③通过离心去掉细胞碎片、染色体DNA和其它杂质，并将水 相的质粒DNA分子用乙醇沉淀出来，最后溶于TE缓冲液或 纯水中备用

SDS法小量制备 植物基因组DNA的的原理 在含有去污剂SDs的溶液中,植物细胞会被裂解释 放出细胞核中的基因组DNA,通过氯仿/异戊醇的抽提 和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂 质,这时的基因组DNA分配在水相中。 然后用乙醇将水相的DNA分子沉淀出来,最后溶于 TE缓冲液或纯水中备用

SDS法小量制备 植物基因组DNA的的原理 在含有去污剂SDS的溶液中，植物细胞会被裂解释 放出细胞核中的基因组DNA，通过氯仿/异戊醇的抽提 和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂 质，这时的基因组DNA分配在水相中。 然后用乙醇将水相的DNA分子沉淀出来，最后溶于 TE缓冲液或纯水中备用

植物基因组DNA的小量快速制备方案 1.剪取新鲜的植物叶片约20mg,剪碎置于15m离心管中; 2.向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片; 3.在液氮蒸发去2/3时,用自制研杵迅速磨碎叶片; 4.立即加入300uL65℃预热的提取液摇匀,于65℃水浴约1hr, 其间摇动数次; 5.加等体积氯仿/异戊醇(241)混匀,于12000rpm离心5分; 6.转移上清液到另一干净15m离心管中,加入2倍体积预冷的无 水乙醇,混匀后静置2min,14000pm离心5min; 7.倾去上清液并用200uL预冷乙醇(70%)清洗DNA沉淀, 1400pm离心5min; 8.用枪头小心吸去乙醇,自然风干DNA后溶于50 ul ddh2O中, 置-20℃保存备用

1. 剪取新鲜的植物叶片约20mg，剪碎置于1.5ml离心管中； 2. 向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片； 3. 在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片； 4. 立即加入300uL 65℃预热的提取液摇匀，于65℃水浴约1hr， 其间摇动数次； 5. 加等体积氯仿/异戊醇（24:1）混匀，于12000 rpm离心5分； 6. 转移上清液到另一干净1.5ml离心管中，加入2倍体积预冷的无 水乙醇，混匀后静置2min，14000rpm离心5min； 7. 倾去上清液并用200uL预冷乙醇（70%）清洗DNA沉淀， 14000rpm离心5min； 8. 用枪头小心吸去乙醇，自然风干DNA后溶于50uL ddH2O中， 置-20℃保存备用。 植物基因组DNA的小量快速制备方案

DNA提取液的配方 Ingredient of the genomic DNA extracting solution 成分 工作浓度 Ingredient working concentration Tris' CI(pH8.0) 100mM EDTA (pH8.0) 5mM 500mM SDS 125% PⅤP

DNA提取液的配方 Ingredient of the genomic DNA extracting solution 成 分 Ingredient 工作浓度 working concentration Tris·Cl（pH8.0） 100mM EDTA（pH8.0） 5mM NaCl 500mM SDS 1.25% PVP 1%

DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 仪器 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪; 药品 Agarose、 loading buffer、 TAE buffer、 EB(溴化乙锭) 上样缓冲液(6X)配方 0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、40%蔗 糖;水溶液4℃保存

DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 + - 仪器 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪； 药品 Agarose、 loading buffer、 TAE buffer、 EB（溴化乙锭）、 上样缓冲液（6X）配方 0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、40%蔗 糖；水溶液4℃保存

第六章基因工程的基本技术 第一节DNA的分离和检测 第二节DNA聚合酶链式反应(PCR) 第三节DNA的序列分析 第四节植物转基因技术

第六章 基因工程的基本技术 第一节 DNA的分离和检测 第二节 DNA聚合酶链式反应（PCR） 第三节 DNA的序列分析 第四节 植物转基因技术

Polymerase Chain Reaction (PCR) 5’- CCTAGCGATT3’ forward primer 5'-ATCCTAGCGATTACCGAATCTTAGTGCTGAAAGTGTCCCGATATAG-3 3'-TAGGATCG CTAATGGCTTAGAATCACGACTTTCACAGGGCTATATC-5 reverse primer 32-CAGGGCTATA-5' 5·ATcc工 AGCGATACCGAACAGGCTGAAAGTGTCCCGA工ATAG33 3-AGGATCGCTAATGGCTAGAATCACGACTTTCACAGGGCTATATC-5> Denature DNA 94 SATCCTAGCGATTACCGAATCTTAGTGCTGAAAGTGTCCCGATATAG-3 3TAGGATCGCTAATGGCTTAGAATCACGACTTTCACAGGGCTATATC-5' Anneal primers 56c 5·ATC@工 AGCGA工工 ACCGAATCTAC工GC工 GAAAG工 GCCCGA工ATAG33 3-CAGGGCTATA-53 S-CCTAGCGATT-33 3-TAGGATCGCTAATGGCTTAGAATCACGACTTTCACAGGGCTATATC-5> 卫 xtend NA 72c S-ATCCTAGCGATTACCGAATCTTAGTGCTGAAAGTGTCCCGATATAG-3 GACTTICACAGGGCTATA-5 S-CCAGCGATACCGAATC 3AGGATCGCTAATGGCTAGAATCACGACTTTCACAGGGCTATATC-S

Polymerase Chain Reaction（PCR） 94 72 56

535 en nature and a primers 353 Cycle 1 Extend dNA 3 3 5=3533 Denature and anneal primers Extend DNA Cycle 2 533 3 5 Denature and anneal prime 5 Extend DNA 3 Cycle 3