《基因操作主要技术原理》讲义

基因操作主要技术原理 basic principles of gene manipulation

基因操作主要技术原理 basic principles of gene manipulation

目的基因的表达 制备大量目的基因片段 鉴定目的基因(凝胶电泳、测序、核酸杂交 重组DNA 转化 宿主细胞 抗生素筛选,彧蓝白斑筛选 重组子的筛选 表送蛋白的收集,纯化

目的基因的表达 ▪ 制备大量目的基因片段 ▪ 重组DNA ▪ 宿主细胞 ▪ 重组子的筛选 ▪ 表达蛋白的收集，纯化 鉴定目的基因 (凝胶电泳、测序、核酸杂交) 转化 抗生素筛选，或蓝白斑筛选 PCR

基因扩增 gene amplification 基因扩增的定义 ■PCR技术的基本原理和特点 影响因素 PCR技术的研究应用 「PCR扩增效率的指标 有效性、特异性、忠实性

1.基因扩增gene amplification ▪ 基因扩增的定义 ▪ PCR技术的基本原理和特点 ▪ 影响因素 ▪ PCR技术的研究应用 ▪ PCR扩增效率的指标： 有效性、特异性、忠实性

The Nobel Prize in Chemistry 1993 for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry for his invention of the polymerase chain reaction(PCR) method Kary B. Mullis La Jolla CA usa B:1944

The Nobel Prize in Chemistry 1993 "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry" "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method" Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA B:1944

孩酸凝胶电泳 gel electrophoresis 基本原理 电泳迁移率 凝胶的分辨能力 溴化乙锭( ethidium bromide,EB 用途:可用于分离、鉴定、纯化DNA 脉冲电场凝胶电泳(pu| sed-field gel electrophoresis, PFGE)

2.核酸凝胶电泳 gel electrophoresis ▪ 基本原理 电泳迁移率 凝胶的分辨能力 溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr) ▪ 用途: 可用于分离、鉴定、纯化DNA ▪ 脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)

3DNA核苷序列分析 Sanger双脱氧链终止法 基本原理 Sange双脱氧M13体系DNA序列分析法 > Maxam- Gilbert化学修饰法 基本原理 两种测序方法的比较 DNA序列分析的自动化

3.DNA核苷酸序列分析 ➢Sanger双脱氧链终止法 基本原理 Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法 ➢ Maxam-Gilbert化学修饰法 基本原理 ➢ 两种测序方法的比较 ➢ DNA序列分析的自动化

4核酸分子杂交 基本原理 用途: DNA/DNA的杂交,可用于检测特定生物之 间是否存在着亲缘关系; DNA/RNA的杂交,可揭示核酸片段中某 特定基因的位置

4.核酸分子杂交 ▪ 基本原理 ▪ 用途: DNA/DNA的杂交,可用于检测特定生物之 间是否存在着亲缘关系; DNA/RNA的杂交,可揭示核酸片段中某一 特定基因的位置

实验步骤 Southern blotting diagram 一核酸印迹转移 Northern blotting 电泳凝胶核酸印迹法 斑点和狭线印迹法( dot and slot blotting) 菌落和噬菌斑印迹法 colony and plaque blotting) 印记杂交

▪ 实验步骤: 核酸印迹转移 电泳凝胶核酸印迹法 斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting) 菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting) 印记杂交 Southern blotting Northern blotting diagram

⑤细菌转化( ansformation 基本原理 diagram 感受态( competence)出现的机制 过程 用途:是获得新的遗传性状的一种手段,是微 生物遗传、分子遗传、基因工程等领域的基 本实验技术

5.细菌转化(transformation) ▪ 基本原理 diagram 感受态(competence)出现的机制 ▪ 过程 ▪ 用途: 是获得新的遗传性状的一种手段，是微 生物遗传、分子遗传、基因工程等领域的基 本实验技术

Bacterial Transforming DNA chromosome DNA binding protein Competence specific single-stranded DNA binding protein (c) Nuclease Free nucleotides Figure 9. 14 Mechanism of DNA transfer by transformation Reca protein membrane-bound DNA binding protei ng of free DNA by a in a gram-positive bacterium. (a) Bind in(b)Passage of one of the two strands into the cell while nuclease activity degrades the other strand. (c) The single strand in the cell is bound by specific proteins, and recombination with homol- ogous regions of the bacterial chromosome mediated by RecA protein occurs. (d) Transformed cell