湖南中医药大学：《生物工程概论》课程电子教案（PPT教学课件）第三讲 基因工程的酶学基础

湖南中医药大学研究生选修课 Principles of Genetic Engineering 基因工程原理 湖南中医药大学鲁耀邦

湖南中医药大学研究生选修课 Principles of Genetic Engineering 基 因 工 程 原 理 湖南中医药大学 鲁耀邦

基因工程原理纲要 基因工程概论 基因工程的主要技术 基因工程的酶学基础 基因克隆的载体与受体 目的基因的克隆与分离 克隆基因的检测与功能鉴定

基因工程原理纲要 基因工程概论 基因工程的主要技术 基因工程的酶学基础 基因克隆的载体与受体 目的基因的克隆与分离 克隆基因的检测与功能鉴定

第三讲基因工程的酶学基础 用于核酸操作的工具酶 狠制性核酸内切酶 ●DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶

用于核酸操作的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸外切酶 核酸修饰酶 第三讲 基因工程的酶学基础 单链DNA内切酶

第一节限制性核酸內切酶 基本概念及其生物功能 核酸酶( nuclease):通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的 磷酸二酯键,从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋 白酶。其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶 ( RNase),而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸 酶 DNase) 按水解断裂核酸分子的方式不同,可分为两种类型:一类是 从核酸分子的末端开始,一个一个核苷酸地消化降解多核苷 酸链,叫核酸外切酶( exonuclease);另一类是从核酸分子内 部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段,叫核酸内切酶 (endonuclease)

核酸酶(nuclease) ：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的 磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋 白 酶 。其 中专 门 水解 断裂 RNA 分子 的 叫做 核糖 核酸 酶 (RNase)，而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸 酶(DNase)。 按水解断裂核酸分子的方式不同，可分为两种类型：一类是 从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷 酸链，叫核酸外切酶(exonuclease)；另一类是从核酸分子内 部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫核酸内切酶 (endonuclease)。 第一节 限制性核酸内切酶 一、基本概念及其生物功能

第一节限制性核酸内切酶 基本概念及其生物功能 限制性核酸内切酶( Restriction endonuclease)是一类 能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4 8bp),并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》统计, 仅川型限制性核酸內切酶就已从各种不同的微生物中分 离出了2300种以上,可识别230种不同的DNA序列

限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)是一类 能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4- 8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 第一节 限制性核酸内切酶 一、基本概念及其生物功能 据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》统计， 仅II型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分 离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列

1.来源 主要是从原核生物中分离纯化出来。 2.性质 内切酶。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 3.功能 帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制和修饰系统(RM体系)

2. 性质 内切酶。 主要是从原核生物中分离纯化出来。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 帮助细菌限制外来DNA的入侵 3. 功能 细菌的限制和修饰系统（R/M体系） 1. 来源

(1)限制( Restriction) 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切 成小片断 Restriction anzyme \ ECORI Unmethylated 5 3 NA 3 浮匚 5 Cleavage Sticky end AATT CD 3 CT TAA 5

限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切 成小片断。 （1）限制（Restriction）

(2)修饰( Modification) 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ①Dam甲基化酶 GATC腺嘌呤N6位置引入甲基 ②Dcm甲基化酶 CCAGG或 CCTGG序列在第二个C上C5 位置上引入甲基

细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 （2）修饰（Modification） ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5 位置上引入甲基

b ECORI methylase Unmethylated 5 GAAT T CE 3 DNA 3 C T TAAG 5 Restriction\ enzye ECORI EcoRI will not cleave methylated DNA Methylated 5 GA ATTC 3 DNA CTTAA G CH

Enzyme Sequence Dam Dcm CpG Aat GACGTc Acc I GTMKAC □ol ACC65 GGTACC □scol□scol Aci l CCGC Acl I AACGTT Acu I CTGAAG(16/14) Afe AGCGCT Afl ll CTTAAG ●●●● Afl ll ACRYGT Age I ACCGGT Ahd GACNNNNNGTc □scol 图标说明: 不敏感完全阻断□sool某些重叠组合后被阻 断o重叠性阻断◆阻碍◇重叠性阻碍 ◇sool某些重叠组合后被阻碍 Referhttp://rebase.neb.com/rebase/

Enzyme Sequence Dam Dcm CpG Aat II GACGTC ● ● ■ Acc I GTMKAC ● ● □ol Acc65 I GGTACC ● □scol □scol Aci I CCGC ● ● ■ Acl I AACGTT ● ● ■ Acu I CTGAAG(16/14) ● ● ● Afe I AGCGCT ● ● ■ Afl II CTTAAG ● ● ● Afl III ACRYGT ● ● ● Age I ACCGGT ● ● ■ Ahd I GACNNNNNGTC ● ● □scol 图标说明： ● 不敏感 ■完全阻断 □scol某些重叠组合后被阻 断 □ol重叠性阻断 ◆阻碍 ◇ol重叠性阻碍 ◇scol某些重叠组合后被阻碍 Refer: http://rebase.neb.com/rebase/