内蒙古大学：《仪器分析化学》课程教学资源（PPT课件）第十六章 分子发光分析法 第二节 分子荧光和磷光分析法

第十六章 一、仪器与结构流程 分子发光分析法 instrument and general process molecular luminescence 二、荧光分析法和应用 analysis fluorescence analysis and application 第二节 三、磷光分析法的应用 分子荧光与磷光分析法 phosphorescence analysis and application molecular fluorescence and phosphorescence analysis 下一页 231212

23:12:12 第十六章 分子发光分析法 一、 仪器与结构流程 instrument and general process 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and application 第二节 分子荧光与磷光分析法 molecular luminescence analysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis

、 仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 光源 的第一单色器和选择发射 第一单色器 或 光（测量）波长的第二单色 滤光片 记录仪 器； 激发 荧光 第二单色器 光源：灯和高压汞灯，染 或 滤光片 料激光器（可见与紫外区） 样品池 检测器 检测器：光电倍增管。 荧光分析仪基本部件示意图 23:12:12

23:12:12 一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管

仪器光路图 日立F-4500荧光分光光度计的光学系统图 1一氙灯(150W)；2一透镜；3一光束分裂器，4,11一水平夹缝； 5一激发单色器光栅；6一参考光电管，7一光闸：8一样品池； 9一样品室光闸；10一发射单色器光栅；12一光电倍增管(R-3788) 23:12:12

23:12:12 仪 器 光 路 图

仪器框图 12 该型仪器可进 13 16 行荧光、磷光 10 和发光分析： 11 与9 通 与8通 与3通 附件 LS50B发光分光光度计框图 1一电源，2一氙灯，3一澈发单色器；4一激发夹缝和光栅马达： 5一参考光电倍增管，6一光束分裂器：7一样品室；8一滤光片轮， 9一发射单色器，10一发射夹缝和光栅马达，11一光电倍增管， 12-模拟子系统，13一CPU系统，14一光电倍增管电压稳定单元： 15一步进马达控制，16一计算机 23:12:12

23:12:12 仪器框图 该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；

同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差（△入）和固定能量差及可 变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率；如图。 合适的△)可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似，发射光谱严重重叠，但 300 400 △入60nm时，只显示色 乙醇溶液中的荧光发射谱(a) 氨酸的特征光谱，实现分别测定。 和混合物的同步荧光光谱(b) 23:12:12

23:12:12 同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。 合适的可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似 ， 发射光谱严重重叠 ， 但 60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定

可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧（磷）光光谱图 EX EM 00 600 A/nm 常规激发光谱和发射光谐 600 带正交多色器光学系统和硅强化靶多通道检测器的 100 快速扫描荧光分光光度计组成示意图 500 600 700 1一硅强化靶多通道检测器：2一分析多色器：3一场透镜：4一透镜系统 入m/nm 5一样品池，6一激发多色器，7,9-150W氙灯，8一激发单色器 图 三维光谱 23:12:12

23:12:12 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图

磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： (1)通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 发射光 (2)采用脉冲光源和可控 发射 检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要 转简式磷光镜(a)和转盘式磷光镜(b) 杜瓦瓶。 1一试样池，2一杜瓦瓶，3一电机轴 23:12:12

23:12:12 磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要 杜瓦瓶

二、荧光分析方法与应用 1. 特点 (1)灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1~0.1μg/cm3 相对灵敏度：0.05mo1/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 (2) 选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； (3)试样量少 缺点：应用范围小。 23:12:12

23:12:12 二、荧光分析方法与应用 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小

2.定量依据与方法 ()定量依据 荧光强度I正比于吸收的光量I,和荧光量子效率φ： I=φa 由朗-比耳定律：I=Io(1-10e1c) L=01(1-10e1c)=p1(1-e2.3e1c) 浓度很低时，将括号项近似处理后： I=2.3φI8lc=Kc 23:12:12 页下

23:12:12 2.定量依据与方法 (1)定量依据 荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If =  Ia 由朗-比耳定律：Ia = I0 (1-10- l c ) If =  I0 (1-10- l c ) =  I0 (1-e -2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3  I0  l c = Kc

(2)定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲 线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较； 23:12:12

23:12:12 （2）定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲 线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；