《分子克隆技术系列一利用质粒载体克隆水稻D片段》讲义

分子克隆技术

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系列

系列一 利用质粒载体克隆水稻DNA片段

多克隆位点 外源DNA 限制性內切酶酶切 限制性内切酶酶切 3-0H 30H 5°P 30H CIAP去除5磷酸 30H T4连接酶连接 转化E.Coli

CIAP去除5‘磷酸 外源DNA 限制性内切酶酶切 5‘P 3‘OH 5’P 3‘OH 5’P 5’P 3‘OH 3‘OH T4连接酶连接 5’OH 5’OH 3’OH 转化E.Coli 限制性内切酶酶切 多克隆位点 3’OH

载体必备条件: 1.是一个复制子; 2.载体在受体细胞中能大量繁殖,其携带的外 源基因才能在受体细胞中得到大量扩增 3.有1到几个限制内切酶的单一识别与切割位 点,便于外源基因的插入; 4.具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记 等)以此知道它是否已进入受体细胞,并据 此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来

载体必备条件： 1. 是一个复制子； 2. 载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外 源基因才能在受体细胞中得到大量扩增； 3. 有1到几个限制内切酶的单一识别与切割位 点，便于外源基因的插入； 4. 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记 等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据 此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来

基因克隆相关载体: Plasmid Cosmid. fosmid PI YAC(Yeast Artificial Chromosome) BAC(Bacterial Artificial Chromosome MAC(Mammalian Artificial Chromosome) PAC(PI-derived Artificial Chromosome) BIBAC (Binary-BAC TAC(Transformation-competent Artificial Chromosome)

基因克隆相关载体： • Plasmid • Cosmid, Fosmid • P1 • YAC (Yeast Artificial Chromosome) • BAC (Bacterial Artificial Chromosome) • MAC (Mammalian Artificial Chromosome) • PAC (P1-derived Artificial Chromosome) • BIBAC (Binary-BAC) • TAC (Transformation-competent Artificial Chromosome)

质粒的基本特点 质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子, 大小在1-20kb之间,是双链闭合环状DNA分子 具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它 们恒定的拷贝数可表达它所携带的遗传信息。它 可独立游离于细胞质中,也可整合到细菌染色体 上。质粒在细胞内的复制可分为严谨型(只在细 胞周期的一定阶段进行复制,一个细胞内只有1 至几个拷贝)和松弛型(细胞周期中随时可以复 制,拷贝数较多,一般在细胞内有20个以上)

质粒的基本特点 质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子， 大小在1－20kb之间，是双链闭合环状DNA分子， 具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它 们恒定的拷贝数可表达它所携带的遗传信息。它 可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体 上。质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细 胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1 至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复 制，拷贝数较多，一般在细胞内有20个以上）

E coli的pSC10是第一个用来作为克隆 载体的质粒,其包含一个 ECoR I酶切位点 及四环素抗性基因(tetr) pBR322是最早被广泛应用的克隆载体 之一,它包含 ampicillin和 Tetracycline抗性 基因和多种限制性内切酶的单一切点。许多 第二代、第三代的克隆载体都是从pBR322 衍生而来

E.coli 的pSC101是第一个用来作为克隆 载体的质粒，其包含一个EcoR I 酶切位点 及四环素抗性基因（tetr ) pBR322是最早被广泛应用的克隆载体 之一，它包含ampicillin和tetracycline抗性 基因和多种限制性内切酶的单一切点。许多 第二代、第三代的克隆载体都是从pBR322 衍生而来

实验一、质粒的抽提 实验目的:掌握减法抽提质粒的原理、步骤及 各试剂的作用 实验材料:含有pUC18载体的大肠杆菌 实验步骤: 1.细菌培养物的生长 2.细菌的收集及裂解 3.质粒的沉淀

实验一、质粒的抽提 实验目的：掌握减法抽提质粒的原理、步骤及 各试剂的作用 实验材料：含有pUC18载体的大肠杆菌 实验步骤： 1. 细菌培养物的生长 2. 细菌的收集及裂解 3. 质粒的沉淀

细菌培养物的生长 从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素 的培养基中,培养至对数生长后期即可 (松驰型质粒〕。严谨型质粒(拷贝数较 低)可采用绿霉素扩增的办法来扩增质粒;

细菌培养物的生长 从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素 的培养基中，培养至对数生长后期即可 （松驰型质粒〕。严谨型质粒（拷贝数较 低）可采用绿霉素扩增的办法来扩增质粒；

细菌的收集及裂解: 通过离心收集菌体;细菌的裂解可采用 离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处 理或加热处理等方法。(具体采用何种方法 取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后 纯化质粒的方法)

细菌的收集及裂解： 通过离心收集菌体；细菌的裂解可采用 离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处 理或加热处理等方法。（具体采用何种方法 取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后 纯化质粒的方法）