《PCR及分子标记生物工程基因诊断》讲义

PCR及分子标记

PCR 及分子标记

PCR Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation primer annealing, polymerization Peoples choice Reaction

PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction

The PCR cycle 95C step to denature the duplex dna An annealing step of around 55c to allow the primers to bind 72C polymerization step g2+, dNTPs are required in addition to template, primers, buffer and enzyme

The PCR cycle • 95C step to denature the duplex DNA, • An annealing step of around 55C to allow the primers to bind, • 72C polymerization step. • Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and enzyme

历史 605-705:基因的体外分离技术。 Khorana(1971):美国MT教授、1968年 诺贝 尔医学奖得主“经过DNA变性,与合适引物 杂交,用DNA聚合醃伸引物,并不断重复 该过程便可克隆tRNA基因” 核酸体外扩增最早设想遗忘: 当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物 当时(1970) Smith等发现了内切酶,体外克 隆基因成为可能

历史 60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年 诺贝 尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适引物 杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复 该过程便可克隆tRNA基因” 。 核酸体外扩增最早设想遗忘: 当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克 隆基因成为可能

Kary Mullis(1985) 发明过程 Ⅵuis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: 丶这种简单得令人惊奇,可以无限量地拷贝DNA 片段的方法是在不可想象的情况下,即驾车行驶在 月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的 发展过程: 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段, 该酶不耐热,每次加热变性DNA后都要重新补加。 耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得 自动化

Kary Mullis(1985) 发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA 片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾车行驶在 月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的” 。 发展过程： 开始使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段， 该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。 耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得 自动化

专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年, Du Pont异议,大小公司对簿公堂,将决定 谁将获得诺贝尔奖。DuPoηt理由是,1971年PCR的 雏形已由 Khorana一系列文章阐明,并公布于众,应 当是公共产权。斯坦福大学 Kornberg(研究DNA聚 酶获诺贝尔奖)也认为,任何具备生物技术知识的 人都可以从 Khorana等的文章中推知如何操作PCR 美国专利局驳回 DuPont异议,地方法院判属 Cetus Cetus获胜后马上反诉,指出 DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR 有关试剂和仪器

专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定 谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR•的 雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应 当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚 合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的 人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR 有关试剂和仪器

PCR发展速度 惊人,没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993媽度诺贝尔化学奖:Muis,与开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大 籍英国科学家 Michael smith共获

PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993•年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大 籍英国科学家Michael Smith共获

原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物 冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶 序列发生退火,再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复 性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是 在合适条件下的这种循环的不断重复

原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA•模板加热变性解链，随之将反应混合物 冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶 序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复 性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是 在合适条件下的这种循环的不断重复

procedures template dna or pre-denaturation RNA denature prlmers completel Tag enzyme, · Denaturation °10× pcr buffer, annealing g Elongation 5mmo1/L dNTPs cycles: 25-30

procedures • template(DNA or RNA), • primers, • Taq enzyme, • 10×PCR buffer, • Mg++, • 5mmol/L dNTPs • pre-denaturation-- denature completely • Denaturation • annealing • Elongation • cycles:25-30

Primer design Most imp (length: 2030bp (2)G+C contents: ATCG random distributed (3)primers: no complementary sequence (4 3end of the primer: no modification (55end of the primer: product length, can be modified (6 specificity: less than 70% homolo gy with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base

Primer design Most imp. (1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be modified (6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base