安徽医科大学基础医学院：《分子生物学》课程教学资源（PPT课件讲稿）第13章 细胞凋亡检测

第十三章 知胞凋亡检测

第十三章 细 胞 凋 亡 检 测

细胞调亡的几种检测方法 > 形态学观察：普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜 >磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin Vi法) > 线粒体膜势能的检测 >DNA片断化检测：大分子染色体DNA片段、 、DNA Ladder >脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL) >半胱复酸蛋白酶Caspase家族活性的检测

细胞凋亡的几种检测方法 ➢ 形态学观察：普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜 ➢ 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） ➢ 线粒体膜势能的检测 ➢ DNA片断化检测：大分子染色体DNA片段、 DNA Ladder ➢ 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL） ➢ 半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的检测

川形态学特征 空池化 ]山缩 山芽 边集 调亡小体 细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质 密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜 内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可 将凋亡细胞遗骸分割句寒为几个凋亡小体

细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质 密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜 内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可 将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体

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形态学观察 光学显微镜和倒置显微镜： 体积缩小核深染、； 核碎裂、 凋亡小体形成、无炎症反应 荧光显微镜和激光共聚焦显微镜：DNA特异性染料 Hoechest 33342/33258,DAPI 透射电子显微镜：超微结构是诊断调亡的最可靠指标

形态学观察 ✓ 光学显微镜和倒置显微镜：体积缩小、核深染、核碎裂、 凋亡小体形成、无炎症反应 ✓荧光显微镜和激光共聚焦显微镜： DNA特异性染料 （ Hoechest 33342/33258, DAPI） ✓ 透射电子显微镜：超微结构是诊断凋亡的最可靠指标

control stage Ila pro-apoptosis nuclei() 图2电子显微镜观察Jurkat细孢调亡过程中 核染色质的形态学改变 电镜下；凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集， 不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团 块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱 三 开形出左安周一木

电镜下：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集， 不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团 块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱 落后，形成许多凋亡小体

Annexin 1V法 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS):细胞调亡早 期从内侧翻转到细胞膜表面 Annexin V:钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS可高亲和力 特异性结合.由于PS外膜化比调亡引起的核酸变化更早，所 以该试剂盒比DNA检测法能更早期检测细胞凋亡 Annexin V-FITC Apoptosis Externalization of Piasma phosphatidyiserine membrane Cytoplasm Cytoplasm

Annexin V法 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）：细胞凋亡早 期从内侧翻转到细胞膜表面 Annexin V:钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS可高亲和力 特异性结合.由于PS外膜化比凋亡引起的核酸变化更早，所 以该试剂盒比DNA检测法能更早期检测细胞凋亡

Annexin V与PI联合 碘化丙啶(propidine iodide,PD是一种核酸染料， 它不能透过完整的细胞膜，但在调亡中晚期的细胞 PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin- V与P匹配使用，可检测早晚期的调亡细胞。 已开发出多种荧光标记的试剂盒

Annexin V 与 PI联合 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料， 它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞， PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin￾V与PI匹配使用，可检测早晚期的凋亡细胞。 已开发出多种荧光标记的试剂盒

荧光显微镜结果 流式细胞仪分析 109 A No Fas mAb B Fas mAb (4h) 101 102 . 10 10 10 10 102 1010910 1010310的10 Annexin V-FITC

流式细胞仪分析 荧光显微镜结果

DNA片断化检测 细胞调亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质 DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50~300kb长的 DNA大片段，或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电 泳上表现为梯形电泳图谱DNA ladder)。 Oh 8h 16h 24h 36h48h 172h 图6撒除GM-CSF诱导调亡的TF-1细胞出现DNA Ladder

DNA 片 断 化 检 测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质 DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kb长的 DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电 泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)