《植物生理学 PLANT PHYSIOLOGY》课程教学资源（PPT讲义课件）基因芯片的制作

基因花片的制作

基因芯片的制作

基因芯片技术流程 基因芯片的制备制备方法及点样仪器 杂交 探针的制备:标记方法 杂交:杂交液、杂交温度、 洗擦条件的选择 检测 扫描化:激光 CCD 数据分析 分析软件的开发

基因芯片技术流程 制备方法及点样仪器 •探针的制备：标记方法 •杂交：杂交液、杂交温度、 洗涤条件的选择 扫描仪:激光 CCD 分析软件的开发 基因芯片的制备 杂交 检测 数据分析

芯片的制备 原位合成 高 厘米) <25 ONA 测序 微量点样(针点、喷墨 平 D 等 对

芯片的制备 • 原位合成 –高密度（可达40万点/1.6平方厘米） –<25bp –ONA –测序分析，寻找点突变 (Hyseq专利保护) • 微量点样（针点、喷墨〕 –较高密度（可达10万点/6.5平方厘米） –500~5000bp –DNA、抗体抗原、受体药物等 –对比分析

靶基因 C33标记A组织 混合探针 杂交标记B组织 以两种波长的激光扫描 B 数据分析、寻找差异表达的基因

数据分析、寻找差异表达的基因 靶基因 Cy3标记A组织 Cy5标记B组织 混合探针 以两种波长的激光扫描 杂交 A B

杂交实验条件 探针的制备 杂交 标记方法 杂交体积(使核酸浓度增加 10万倍) PCR 玻片:2-200μl 逆转录 滤膜:5-50ml 随机引物 杂交液和杂交液的组份 缺口翻译 杂交温度、时间 标记物 洗涤条件 同位素 荧光染料 洗涤液的组成 化学发光 洗涤的温度、时间

杂交实验条件 • 探针的制备 标记方法 PCR 逆转录 随机引物 缺口翻译 标记物 同位素 荧光染料 化学发光 • 杂交 杂交体积(使核酸浓度增加 10万倍） 玻片: 2-200l 滤膜：5-50ml 杂交液和杂交液的组份 杂交温度、时间 • 洗涤条件 洗涤液的组成 洗涤的温度、时间

核酸分子杂交 探针DNA 靶 dNA C eo 杂交前 杂交后

(探针A+探针B)→混合探针95℃变性 5℃变性 42℃15hrs 杂交 洗片试剂1、2、3 洗涤 543mm扫描 633m扫描

（探针A + 探针 B） 混合探针 95 ℃变性 95 ℃变性 42 ℃ 15hrs 杂交 洗片试剂1、2、3 洗涤 543nm扫描 633nm扫描

Labeling protocols Oligo(dT) primed labeling using SuperScript II Life Technologies)and 4-8 ug total RNA Clean Probes using Pharmacia GFX Columns Hybridization Prehybridize slides with 5XSSC, 0. 1% SDS and 1% BSA to block free amine groups Combine probes with 10XSSC, 0.2% SDS, 50% formamide and hybridize at 42C ON

检测 扫描仪 激光共 光源:特定波长的光 激发面积:<100平方微米 如: ScanArray3000 CCD成 光源:连续波长的光(如弧光灯) 激发面积:同时激发多个1平方厘米的面积

检 测 • 扫描仪 – 激光共聚焦扫描 光源：特定波长的光 激发面积：<100平方微米 如：ScanArray 3000 – CCD 成像术 光源：连续波长的光（如弧光灯） 激发面积：同时激发多个1平方厘米的面积

激光共聚焦扫代的扫括原理 Detector ens Detector Filter Confocal Laser pinhole beam Objective ens Substrate

Detector Confocal pinhole Filter Laser beam Substrate Objective lens Detector lens 激光共聚焦扫描仪的扫描原理