中国农业大学：《种子病理学》课程教学课件（PPT讲稿）第四章 种传病害的检验（2/2）

5、洗涤检验 ■种子表面病菌孢子或颖壳上的病原线虫 ■取样，洗涤，振荡，离心，悬浮 ■培养皿计数法 血球计计数法：80小格求平均数 ■每粒种子的孢子数=1ml中孢子数÷100 ■重复次数

5、洗涤检验 ◼ 种子表面病菌孢子或颖壳上的病原线虫 ◼ 取样，洗涤，振荡，离心，悬浮 ◼ 培养皿计数法 ◼ 血球计计数法：80小格求平均数 ◼ 每粒种子的孢子数=1ml中孢子数÷100 ◼ 重复次数

5、洗涤检验（续) ■培养皿法：N2=N1X（R2R1)2 R视野半径，R2培养皿半径，N视野中孢子数，N2 培养皿中孢子数 ·影响检验结果的因素：表面附着的孢子不一定能洗 下来；悬浮液不能完全悬浮或管壁留有孢子；采用 计数计法，视野间孢子分布不均匀

5、洗涤检验（续） ◼ 培养皿法：N2=N1×（R2 /R1）2 ◼ R1视野半径，R2培养皿半径，N1视野中孢子数，N2 培养皿中孢子数 ◼ 影响检验结果的因素：表面附着的孢子不一定能洗 下来；悬浮液不能完全悬浮或管壁留有孢子；采用 计数计法，视野间孢子分布不均匀

6、漏斗分离检验 ■种子携带线虫的较好方法。 ■水稻干尖线虫；土壤中线虫；活动性较大线虫 (茎线虫，根结线虫，胞囊线虫) ■具体方法（贝尔曼漏斗法）

6、漏斗分离检验 ◼ 种子携带线虫的较好方法。 ◼ 水稻干尖线虫；土壤中线虫；活动性较大线虫 （茎线虫，根结线虫，胞囊线虫） ◼ 具体方法（贝尔曼漏斗法）

7、保湿萌芽检验 种子携带病菌在种子萌芽阶段开始为害，萌发期或幼 苗早期表现症状，或种子未萌芽，种表长出病菌 带菌情况，发芽情况，种内情况（种表消毒) ■1)保湿培养检验（吸水纸，冷冻吸水纸，琼脂平皿法） ·2)砂内萌芽检验法 ■3)土内萌芽检验法 ·4)试管幼苗症状测定法

7、保湿萌芽检验 ◼ 种子携带病菌在种子萌芽阶段开始为害，萌发期或幼 苗早期表现症状，或种子未萌芽，种表长出病菌 ◼ 带菌情况，发芽情况，种内情况（种表消毒） ◼ 1）保湿培养检验（吸水纸，冷冻吸水纸，琼脂平皿法） ◼ 2）砂内萌芽检验法 ◼ 3）土内萌芽检验法 ◼ 4）试管幼苗症状测定法

1)保湿培养检验 吸水纸法 ■吸水纸吸足无菌水，放入培养皿 ■种子排放在吸水纸上，1.0-1.5厘米 20-28℃培养，12小时光照/黑暗 ■有时加入0.1-0.2%的2,4-D溶液代替水 ■优点：应用广，操作方便 ■缺点：真菌不易旺盛长出菌丝和孢子，被掩盖 ■冷冻吸水纸法：10℃3天，20℃2天，-20℃冷冻过夜，20℃12 小时光照/黑暗，形成孢子，避免伸长 ■琼脂平皿法：1.5-1.7%的琼脂液，含水量均一

1）保湿培养检验——吸水纸法 ◼ 吸水纸吸足无菌水，放入培养皿 ◼ 种子排放在吸水纸上，1.0-1.5厘米 ◼ 20-28℃培养，12小时光照/黑暗 ◼ 有时加入0.1-0.2%的2，4-D溶液代替水 ◼ 优点：应用广，操作方便 ◼ 缺点：真菌不易旺盛长出菌丝和孢子，被掩盖 ◼ 冷冻吸水纸法：10℃3天，20℃2天，-20℃冷冻过夜，20℃12 小时光照/黑暗，形成孢子，避免伸长 ◼ 琼脂平皿法：1.5-1.7%的琼脂液，含水量均一

2)砂内萌芽检验法 ■河砂(1mm筛孔)及容器灭菌（干热灭菌） ■冷开水至砂量的60%左右（17%含水量) ■低容器边缘4厘米，排列种子，加砂覆盖2-3厘米 ■25℃培养，幼芽连根拔出 ■幼苗和未发芽种子症状以及种苗上有无孢子 土内萌芽检验法类似（营养丰富) ■试管幼苗症状测定法：长160mm,直径16mm,1%,10ml,20℃12小 时光照/黑暗 优点：根部和绿色，避免相互传染

2）砂内萌芽检验法 ◼ 河砂（1mm筛孔）及容器灭菌（干热灭菌） ◼ 冷开水至砂量的60%左右（17%含水量） ◼ 低容器边缘4厘米，排列种子，加砂覆盖2-3厘米 ◼ 25℃培养，幼芽连根拔出 ◼ 幼苗和未发芽种子症状以及种苗上有无孢子 ◼ 土内萌芽检验法类似（营养丰富） ◼ 试管幼苗症状测定法：长160mm，直径16mm，1%，10ml，20℃12小 时光照/黑暗 ◼ 优点：根部和绿色，避免相互传染

7、保湿萌芽检验（续) 缺点： ·操作麻烦 ■寄主生长发育不良，病菌适宜生长，腐生菌造成类似的病斑 萌芽检验靠肉眼检查，多种病害产生类似症状，同一病害不 同症状 ·种子带菌而萌发期或苗期不表现症状，也不长出病菌孢子的 病害，如麦类黑穗病等，不能应用保湿萌芽检验

7、保湿萌芽检验（续） ◼ 缺点： ◼ 操作麻烦 ◼ 寄主生长发育不良，病菌适宜生长，腐生菌造成类似的病斑 ◼ 萌芽检验靠肉眼检查，多种病害产生类似症状，同一病害不 同症状 ◼ 种子带菌而萌发期或苗期不表现症状，也不长出病菌孢子的 病害，如麦类黑穗病等，不能应用保湿萌芽检验

8、分离培养检验 ■种子内部，不易发现和鉴定的病原菌，或种子虽有病斑，但无 病征或种表携带。 专性寄生物（病毒，白粉，锈菌等）除外 ■应用范围： ·1)分离潜伏于种表或深层的病菌； ·2)确定病菌的潜伏部位； ·3)了解种子外部携带的菌群； ·4)了解种子感染和萌发的总体情况； ·5)分离无性繁殖材料所携带的病菌 ■培养方法：真菌(PDA)，细菌

8、分离培养检验 ◼ 种子内部，不易发现和鉴定的病原菌，或种子虽有病斑，但无 病征或种表携带。 ◼ 专性寄生物（病毒，白粉，锈菌等）除外 ◼ 应用范围： ◼ 1）分离潜伏于种表或深层的病菌； ◼ 2）确定病菌的潜伏部位； ◼ 3）了解种子外部携带的菌群； ◼ 4）了解种子感染和萌发的总体情况； ◼ 5）分离无性繁殖材料所携带的病菌 ◼ 培养方法：真菌（PDA），细菌

细菌的分离培养 ■培养基：肉汁胨培养基（牛肉浸膏3g,蛋白胨5-10g,琼脂17 20g,水1000ml) ■划线分离法：种表消毒磨碎，无菌水将细菌溢出，接种环蘸取 划线。将单个细菌分开，经培养后形成单菌落，获得纯菌株。 ■平板稀释法：病原细菌数量大，稀释培养使病原细菌与杂菌分 开，形成纯培养。培养皿4个，1m无菌水，接种环搅匀，依次 移入2、3、4皿，倒培养基（45℃)

细菌的分离培养 ◼ 培养基：肉汁胨培养基（牛肉浸膏3g，蛋白胨5-10g，琼脂17- 20g，水1000ml） ◼ 划线分离法：种表消毒磨碎，无菌水将细菌溢出，接种环蘸取 划线。将单个细菌分开，经培养后形成单菌落，获得纯菌株。 ◼ 平板稀释法：病原细菌数量大，稀释培养使病原细菌与杂菌分 开，形成纯培养。培养皿4个，1ml无菌水，接种环搅匀，依次 移入2、3、4皿，倒培养基（45℃）

9、整胚检验 ■种子胚部的散黑穗病菌，将胚分离出来，进行透明检验 ■浸泡与染色(5%氢氧化钠，0.02%锥虫蓝，24h) ·提取(10目，20目筛子，收集浸泡于水中) ·脱水（浸泡于200ml无水乙醇，5-10分） ·分离（过滤，100ml乳酸酚溶液，5分，加100ml水，5分) ·透明（收集胚浸于25ml乳酸酚溶液，沸2分) ·检验（胚倒入培养皿，200个按行排列，体视镜)

9、整胚检验 ◼ 种子胚部的散黑穗病菌，将胚分离出来，进行透明检验 ◼ 浸泡与染色（5%氢氧化钠，0.02%锥虫蓝，24h） ◼ 提取（10目，20目筛子，收集浸泡于水中） ◼ 脱水（浸泡于200ml无水乙醇，5-10分） ◼ 分离（过滤，100ml乳酸酚溶液，5分，加100ml水，5分） ◼ 透明（收集胚浸于25ml乳酸酚溶液，沸2分） ◼ 检验（胚倒入培养皿，200个按行排列，体视镜）