《兽医免疫学》课程实验指导（补充材料）

兽医免疫学实验指导补充材料编写郭鑫中国农业大学动物医学院预防兽医学系二00五年十一月

兽医免疫学实验指导 补充材料 郭鑫 编写 中国农业大学动物医学院预防兽医学系 二 00 五年十一月

实验须知在免疫学实验中，可能接触病原微生物，要求工作谨慎、严防实验室感染、防止事故、确保安全。（一）防止病原微生物的散布1．实验室中应着工作服，如沾有可传染的材料，应脱下浸于消毒药水中（如5%石炭酸等）过夜或高压消毒后再进行洗涤。2．沾有微生物的器皿及废弃培养物，应置于指定地点，先消毒后再进行洗涤；检查用过的动物户体、脏器、血液等，应严加消毒、掩理。3．接种环、接种针用前后必须置火焰中烧灼过。4.含有培养物的试管不可平放桌面，以防止其中液体流出。5.实验室中禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔和标签等物，亦勿用手指或他物与面部接触。6.操作危险材料时勿谈话或思考其他问题，以免分散注意力而发生意外。7．实验室中若发生意外，如吸入细菌、划破皮肤、细菌或病料污染桌面或地面等时，应立即处理，必要时就医。为病原微生物所污染的地点，应敷以粘浓消毒药（5%石炭酸等）覆盖过夜。8．菌种或毒种不得带出实验室。9．工作完毕或应先用消毒药水、后用清水洗手。（二）防火一切易燃品应原离火源。不可将酒精灯倾斜向另一酒精灯引火，以免发生爆炸。（三）节约1.使用药品试剂、染色剂、镜油、拭镜纸等应节约。2．使用仪器等要小心，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外。3.吸管插入试管中时，要轻放到底才松手，以免戳破试管。4.平皿一般应翻放，即皿底在上，皿盖在下，以免拿时皿底掉下摔破。5.金属器皿用毕消毒后，应立即擦干，防止生锈。（四）标记1

1 实验须知 在免疫学实验中，可能接触病原微生物，要求工作谨慎、严防实验室感染、防止事故、 确保安全。 （一）防止病原微生物的散布 1． 实验室中应着工作服，如沾有可传染的材料，应脱下浸于消毒药水中（如 5%石炭酸等） 过夜或高压消毒后再进行洗涤。 2． 沾有微生物的器皿及废弃培养物，应置于指定地点，先消毒后再进行洗涤；检查用过的 动物尸体、脏器、血液等，应严加消毒、掩埋。 3． 接种环、接种针用前后必须置火焰中烧灼过。 4． 含有培养物的试管不可平放桌面，以防止其中液体流出。 5． 实验室中禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔和标签等物，亦勿用手指或他物与面部接触。 6． 操作危险材料时勿谈话或思考其他问题，以免分散注意力而发生意外。 7． 实验室中若发生意外，如吸入细菌、划破皮肤、细菌或病料污染桌面或地面等时，应立 即处理，必要时就医。为病原微生物所污染的地点，应敷以粘浓消毒药（5%石炭酸等） 覆盖过夜。 8． 菌种或毒种不得带出实验室。 9． 工作完毕或应先用消毒药水、后用清水洗手。 （二）防火 一切易燃品应原离火源。不可将酒精灯倾斜向另一酒精灯引火，以免发生爆炸。 （三）节约 1．使用药品试剂、染色剂、镜油、拭镜纸等应节约。 2．使用仪器等要小心，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外。 3．吸管插入试管中时，要轻放到底才松手，以免戳破试管。 4．平皿一般应翻放，即皿底在上，皿盖在下，以免拿时皿底掉下摔破。 5．金属器皿用毕消毒后，应立即擦干，防止生锈。 （四）标记

所用各种试剂、染料、培养物、动物等，均需标记明确。要经高压消毒或蒸气消毒的标签，应用深色铅笔或记号笔书写，不可用毛笔或水笔书写，以免消毒后模糊不清。（五）记录每项操作及结果观察都应有详细记录。（六）安全最后一人离开实验室前应对窗户、自来水开关、电源、煤气开关检查一遍，关好，锁门。（七）清洁与秩序每日开始工作前，地面洒水，清洁桌面。实验室中各物均有一定位置，工作完毕后放回原处或指定地点，对实验室整理，清洁后离开。2

2 所用各种试剂、染料、培养物、动物等，均需标记明确。要经高压消毒或蒸气消毒的标 签，应用深色铅笔或记号笔书写，不可用毛笔或水笔书写，以免消毒后模糊不清。 （五）记录 每项操作及结果观察都应有详细记录。 （六）安全 最后一人离开实验室前应对窗户、自来水开关、电源、煤气开关检查一遍，关好，锁门。 （七）清洁与秩序 每日开始工作前，地面洒水，清洁桌面。实验室中各物均有一定位置，工作完毕后放回 原处或指定地点，对实验室整理，清洁后离开

实验一琼脂双向单扩散试验和琼脂双向双扩散试验[实验目的]1.掌握经典血清学反应中沉淀反应的原理和基本方法。2.熟悉用琼脂双向单扩散方法进行抗原的半定量检测。3.熟悉用琼脂双向双扩散方法进行抗原或抗体的定性检测及抗体效价的测定。[实验原理]1.琼脂双向单扩散琼脂是一种含有硫酸基的多糖聚合物，高温时可溶于水，冷却后形成半固体凝胶状。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满液体，孔径的大小取决于琼脂浓度。在1%的琼脂凝胶中，各种抗原或抗体分子可自由扩散。抗原、抗体分子在凝胶中相遇，在比例适当处发生沉淀反应，在辐射型免疫扩散中，抗原、抗体相互结合，在最适比例处形成沉淀环，当琼脂凝胶中的抗原或抗体浓度一定时，沉淀环的大小与扩散的抗体或抗原的浓度成正比。浓度越大，形成的沉淀环也越大。该试验一般用于抗原或抗体的定量测定。2.琼脂双向双扩散可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝胶中相向扩散，在两孔之间比例最合适的位置出现抗原抗体反应沉淀带。用已知抗原或抗体可检测未知的抗体或抗原。该方法已广泛用于临床诊断，抗体效价测定及抗原研究中。【实验内容]1.琼脂双向单扩散（1）将1.2%琼脂用生理盐水溶化，并置于56℃水浴中保温。（2）将抗血清在56℃水浴中预热。（3）在100毫升琼脂中加入一定体积的抗血清（事先经预试验确定加入量），充分混匀。（4）取3.5毫升血清琼脂浇于玻片上，冷却备用。（5）打孔：用打孔器在每个琼脂板上等距离打4个孔，用酒精灯轻轻灼烧玻片另一面进行封底。（6）加样：取抗原做三个稀释度，每个稀释度加一个孔，最后一孔加未知浓度的抗原待检样品。（7）扩散：将玻片放于湿盒中，37℃扩散24小时，观察沉淀环。3

3 实验一 琼脂双向单扩散试验和琼脂 双向双扩散试验 [实验目的] 1．掌握经典血清学反应中沉淀反应的原理和基本方法。 2．熟悉用琼脂双向单扩散方法进行抗原的半定量检测。 3．熟悉用琼脂双向双扩散方法进行抗原或抗体的定性检测及抗体效价的测定。 [实验原理] 1．琼脂双向单扩散 琼脂是一种含有硫酸基的多糖聚合物，高温时可溶于水，冷却后 形成半固体凝胶状。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满液体，孔径的大小取决于琼脂浓度。在 1％的琼脂凝胶中，各种抗原或抗体分子可自由扩散。抗原、抗体分子在凝胶中相遇，在比 例适当处发生沉淀反应，在辐射型免疫扩散中，抗原、抗体相互结合，在最适比例处形成沉 淀环，当琼脂凝胶中的抗原或抗体浓度一定时，沉淀环的大小与扩散的抗体或抗原的浓度成 正比。浓度越大，形成的沉淀环也越大。该试验一般用于抗原或抗体的定量测定。 2．琼脂双向双扩散 可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝胶中相向扩散，在两孔之间比 例最合适的位置出现抗原抗体反应沉淀带。用已知抗原或抗体可检测未知的抗体或抗原。该 方法已广泛用于临床诊断，抗体效价测定及抗原研究中。 [实验内容] 1．琼脂双向单扩散 （1）将 1.2％琼脂用生理盐水溶化，并置于 56ºC 水浴中保温。 （2）将抗血清在 56ºC 水浴中预热。 （3）在 100 毫升琼脂中加入一定体积的抗血清（事先经预试验确定加入量），充分混匀。 （4）取 3.5 毫升血清琼脂浇于玻片上，冷却备用。 （5）打孔：用打孔器在每个琼脂板上等距离打 4 个孔，用酒精灯轻轻灼烧玻片另一面 进行封底。 （6）加样：取抗原做三个稀释度，每个稀释度加一个孔，最后一孔加未知浓度的抗原 待检样品。 （7）扩散：将玻片放于湿盒中，37ºC 扩散 24 小时，观察沉淀环

（8）结果记录：用尺量取沉淀环半径（直径除2），计算各环面积。（9）绘制曲线：以抗原浓度与沉淀环面积为座标轴，根据已知的3个抗原浓度与沉淀环面积绘制曲线。根据曲线和未知浓度抗原的沉淀环面积，可查出其浓度大小。2.琼脂双向双扩散（1）将1.2%琼脂用生理盐水溶化，并置于60℃水浴中保温（2）取3.5毫升溶化的琼脂浇于干净的玻片上，冷却凝固备用。（3）按图4一1打孔。（4）封底：将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。（5）阴阳性定性检测：按图4一1A加样，中央孔加抗原，外周孔1、4加阳性血清，2、5加阴性血清，3、6加待检血清。（6）抗体效价测定：按图4一1B，中央孔加抗原，外周孔1一6加入倍比稀释的血清，每个稀释度加1个孔。（7）扩散：将玻片放于湿盒中，37℃扩散24小时，观察结果。（8）结果判定：当阳性血清与抗原孔之间出现明显、致密清晰的沉淀线时，待检血清与抗原孔形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线末端向邻近待检血清孔偏弯者，此待检血清判为阳性；待检血清与抗原之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向邻近的待检血清孔直伸或远离者，此血清判为阴性；抗体效价的判定是以出现阳性反应（明显清晰的沉淀线）的血清最高稀释度为该血清的琼扩效价。O0O0CO0O0OOOOO图4-1琼脂双向双扩散梅花型孔，孔径约3mm，孔距约5mm[作业]1．每一位学生做一个琼脂双向单扩散，绘制标准曲线，推算出未知抗原浓度。2.每一位学生做一个琼脂双向双扩散，在阳性及阴性结果正确的情况下，判定待检样本的阴阳性。3.回答问题：4

4 （8）结果记录：用尺量取沉淀环半径（直径除 2），计算各环面积。 （9）绘制曲线：以抗原浓度与沉淀环面积为座标轴，根据已知的 3 个抗原浓度与沉淀 环面积绘制曲线。根据曲线和未知浓度抗原的沉淀环面积，可查出其浓度大小。 2．琼脂双向双扩散 （1）将 1.2％琼脂用生理盐水溶化，并置于 60ºC 水浴中保温。 （2）取 3.5 毫升溶化的琼脂浇于干净的玻片上，冷却凝固备用。 （3）按图 4－1 打孔。 （4）封底：将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。 （5）阴阳性定性检测：按图 4－1A 加样，中央孔加抗原，外周孔 1、4 加阳性血清，2、 5 加阴性血清，3、6 加待检血清。 （6）抗体效价测定：按图 4－1B，中央孔加抗原，外周孔 1－6 加入倍比稀释的血清， 每个稀释度加 1 个孔。 （7）扩散：将玻片放于湿盒中，37ºC 扩散 24 小时，观察结果。 （8）结果判定：当阳性血清与抗原孔之间出现明显、致密清晰的沉淀线时，待检血清 与抗原孔形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线末端向邻近待检血清孔偏弯者，此待检血清判 为阳性；待检血清与抗原之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向邻近的待检血清孔直 伸或远离者，此血清判为阴性；抗体效价的判定是以出现阳性反应（明显清晰的沉淀线）的 血清最高稀释度为该血清的琼扩效价。 图 4－1 琼脂双向双扩散梅花型孔，孔径约 3mm，孔距约 5mm [作业] 1．每一位学生做一个琼脂双向单扩散，绘制标准曲线，推算出未知抗原浓度。 2．每一位学生做一个琼脂双向双扩散，在阳性及阴性结果正确的情况下，判定待检样 本的阴阳性。 3．回答问题：

（1）琼脂扩散试验的原理是什么？（2）举例说明琼脂双向单扩散和琼脂双向双扩散的实际用途5

5 （1）琼脂扩散试验的原理是什么？ （2）举例说明琼脂双向单扩散和琼脂双向双扩散的实际用途

实验二血凝和血凝抑制试验[实验目的]1.掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理2.掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法【实验原理]某些病毒（如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。【实验内容］1.红细胞凝集试验（HA试验）主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法，在V形微量反应板上进行。（1）首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴（25叫1）。(2)用微量移液器取病毒抗原液25叫1加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25μ1液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μ1液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:21:2048，第12孔为红细胞对照。(3)再以微量移液器每孔加1.0%红细胞悬浮液1滴(25叫1)。(4)在振荡器上振荡混匀约1～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。（5）每次测定样品都应同时做红细胞对照。表1鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式（微量法)345孔号2678910121111:41:81:161:321:641:21:1281:2561:5121:10241:2048病毒稀释倍数对照生理盐水2525μl25m2525m25m25P2525m25m25u25病毒液25m25m25/25j25M125m>25125叫l5Ml)1/弃去1%红细胞悬液复25μl25ml25μ125μl25μ125μ125μ125μ125μ125μ125μl25μ1感作置振荡器上混匀1~2分钟，放37℃静置15分钟结果例示###一## 一#一#++-T-++表示50%凝集一表示不凝集#表示100%完全凝集6

6 实验二 血凝和血凝抑制试验 [实验目的] 1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 [实验原理] 某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为 红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制， 即为红细胞凝集抑制试验。 [实验内容] 1．红细胞凝集试验(HA 试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑 制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。 鸡新城疫病毒的 HA 试验现采用微量法，在 V 形微量反应板上进行。 (1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25µl)。 (2)用微量移液器取病毒抗原液 25µl 加入第 1 孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病 毒与稀释液混合均匀，再吸取 25µl 液体小心地移至第 2 孔，如此连续稀释至第 11 孔，第 11 孔吸取 25µl 液体弃掉；病毒稀释倍数依为 1:2～1:2048，第 12 孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加 1.0％红细胞悬浮液 1 滴(25µl)。 (4)在振荡器上振荡混匀约 l～2 分钟，再置 37℃作用 15 分钟后观察结果。 (5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。 表 1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法) 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病毒稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照 生理盐水 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 病毒液 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 弃去 1％红细胞悬液 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 感作 置振荡器上混匀 1～2 分钟，放 37℃静置 15 分钟 结果例示 # # # # # # # ++ - - - - # 表示 100％完全凝集 ++ 表示 50％凝集 - 表示不凝集

结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使100%红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1：128，H试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4=32倍的稀释液。2.红细胞凝集抑制试验（HI试验）有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液（即25叫l），从第1孔到第10孔。第11孔加稀释液2滴（50叫l）。(②)以微量移液器取被检血清25叫l，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25叫1液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25叫l液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2~1：1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴（25叫1）至第10孔，第11孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。（4）置振荡器上振荡1~2分钟后，放37℃静置20分钟。(5)每孔再加入1.0%红细胞悬浮液1滴（25叫1）放振荡器上振荡1～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定结果。表2鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验（微量法)孔号121234568910117被检血清稀1:21:4.1:81:161:641:121:251:511:10细细胞抗原1:3280224释倍数6照对照生理盐水25μ50刚l25μ125叫125μl25m25叫25叫25叫25叫25μi25μ1被检血清25μ126M25μ25μ1Y5M95opO弃掉25μ14单位病毒液25叫l25m25l25l25l25m25l25l12525叫l振荡器上振荡1~2分钟，放37℃作用20分钟25μ125A11%红细胞感液25μl25叫l25μl25μl25m25ml25叫l2525μ25μl振荡器上振荡1~2分钟，放137℃作用15分钟结果例示++##一#-1注：一表示不凝集、++表示部分凝集、#表示完全凝集。7

7 结果判定：将反应板倾斜成 45 度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动 者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层， 倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能使 100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如 上例：病毒液的 HA 效价为 1:128，HI 试验时，病毒抗原液 25 微升内须含 4 个凝集单位，则 应将原病毒液作成 128/4＝32 倍的稀释液。 2.红细胞凝集抑制试验(HI 试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说 明。 (1)用微量移液器每孔各加入 1 滴稀释液(即 25µl)，从第 1 孔到第 10 孔。第 1l 孔加稀 释液 2 滴(50µl)。 (2)以微量移液器取被检血清 25µl，放入第 1 孔，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被 检血清与稀释液混合均匀，再吸取 25µl 液体小心地移至第 2 孔，如此连续稀释至第 10 孔， 最后第十孔吸取 25µl 液体弃掉；被检血清稀释倍数依为 1:2～1:1024，第 11 孔为红细胞对 照，第十二孔为抗原对照。 (3)每孔再加入含有四个单位的病毒液 1 滴(25µl)至第 10 孔，第 1l 孔为红细胞对照孔， 不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。 (4)置振荡器上振荡 l～2 分钟后，放 37℃静置 20 分钟。 (5)每孔再加入 1.0％红细胞悬浮液 1 滴(25µl)放振荡器上振荡 l～2 分钟混匀，置 37℃， 15 分钟后判定结果。 表 2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法) 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 被检血清稀 释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:12 8 1:25 6 1:51 2 1:10 24 红细胞 对照 抗原 对照 生理盐水 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 50µl 25µl 被检血清 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 弃掉 4单位病毒液 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 振荡器上振荡 1～2 分钟，放 37℃作用 20 分钟 1%红细胞悬液 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 振荡器上振荡 1～2 分钟，放 137℃作用 15 分钟 结果例示 - - - - - - - ++ # # - # 注： - 表示不凝集 、 ++ 表示部分凝集、 # 表示完全凝集

结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数（10g2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7（10g2)。结果分析：(1)一般认为鸡的免疫临界水平为1:8（成年)或1:16（鸡），随地区不同而稍有差异。(2)鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。(3)鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价（log2)的平均值表示的。如果某鸡群的10份样品中，H抗体效价（log2）为8的有3份样品，为7的有5份样品为6的有2份样品，它们的平均值为：8×3+7×5+6×2/3+5+2=7.1平均水平在4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。(4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于0.1%一0.5%，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为2.0%。(5)鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中的H抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。[作业]1。每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。2.根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果3.回答问题：（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？（2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？（3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？80

8 结果判定：将反应板倾斜成 45 度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动 者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄 层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能将 4 单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红 细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以 2 为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清 的红细胞凝集抑制效价为 1：128 或 HI 效价为 7(10g2)。 结果分析： (1)一般认为鸡的免疫临界水平为 1:8(成年)或 1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。 (2)鸡血清 HI 抗体效价高于 1:16 时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI 抗体效价在 1:16 以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。 (3)鸡群的 HI 抗体水平是以抽检样品的 HI 抗体效价(㏒ 2)的平均值表示的。 如果某鸡群的 10 份样品中，HI 抗体效价(㏒ 2)为 8 的有 3 份样品，为 7 的有 5 份样品， 为 6 的有 2 份样品，它们的平均值为： 8×3＋7×5＋6×2/3＋5＋2＝7.1 平均水平在 4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。 若在检样中 HI 抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根 据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。 (4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1％一 0.5％，小型鸡群，抽样 率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为 2.0％。 (5)鸡群接种新城疫疫苗后，经 2～3 周测血清中的 HI 抗体效价，若提高 2 个滴度以上， 表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若 HI 抗体效价无明显提高，表示免疫失败。 [作业] 1．每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。 2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成 4 个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验， 检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果 3．回答问题： （1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？ （2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？ （3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？

实验三酉酶联免疫吸附实验（间接法）【实验目的]以检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体为例，掌握酶联免疫吸附试验的原理、操作方法及结果的判定。【实验原理］酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。其原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体反应形成复合物，再加入酶标记的抗原或抗体。此时固相载体上的酶量与标本中受检物质的量呈一定比例。加入与酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值即可进行定性或定量分析。在实际应用中，ELISA可以有多种设计、多种操作形式，如：用于检测抗体的间接法和用于检测抗原的双抗体夹心法等。[实验内容]1.包被一定浓度的抗原液（以0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液配制）加入酶联反应板各孔，每孔200微升，置4℃冰箱过夜或37℃2小时。2.洗涤倾去孔内液体，用洗涤液注满各孔，洗涤3次，每次3分钟，然后去尽洗涤液。3.封闭每孔加入100微升封闭液，37℃半小时，然后倾去孔内液体。4.加样（1）将6份待检血清样品用稀释液分别稀释成1：40，分别加入1-6孔，每孔100微升。(2）第7孔设为阳性血清对照，第8孔设为阴性血清对照，每孔100微升。（3）加样后，置37℃孵育45分钟。5.洗涤同步骤26.加辣根过氧化物酶标记的免抗猪IgG抗体（其稀释度根据预试结果而定），每孔10C微升，置37℃孵育30分钟。9

9 实验三 酶联免疫吸附实验（间接法） [实验目的] 以检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体为例，掌握酶联免疫吸附试验的原理、操作方法及 结果的判定。 [实验原理] 酶联免疫吸附实验( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)的基础是抗原或抗体的 固相化及抗原或抗体的酶标记。其原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，受检标本与固 相载体表面的抗原或抗体反应形成复合物，再加入酶标记的抗原或抗体。此时固相载体上的 酶量与标本中受检物质的量呈一定比例。加入与酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产 物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度(OD) 值即可进行定性或定量分析。 在实际应用中，ELISA 可以有多种设计、多种操作形式，如：用于检测抗体的间接法和 用于检测抗原的双抗体夹心法等。 [实验内容] 1．包被 一定浓度的抗原液（以 0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液配制）加入酶联反应板各 孔，每孔 200 微升，置 4℃冰箱过夜或 37℃ 2 小时。 2．洗涤 倾去孔内液体，用洗涤液注满各孔，洗涤 3 次，每次 3 分钟，然后去尽洗涤 液。 3．封闭 每孔加入 100 微升封闭液，37℃半小时，然后倾去孔内液体。 4. 加样 (1) 将 6 份待检血清样品用稀释液分别稀释成 1：40，分别加入 1-6 孔，每孔 100 微升。 (2) 第 7 孔设为阳性血清对照，第 8 孔设为阴性血清对照，每孔 100 微升。 (3) 加样后，置 37℃孵育 45 分钟。 5. 洗涤 同步骤 2 6. 加辣根过氧化物酶标记的兔抗猪 IgG 抗体（其稀释度根据预试结果而定），每孔 100 微升，置 37℃孵育 30 分钟