遵义医科大学附属医院医学检验科：《临床分子生物学检验技术》课程教学资源（课件讲稿）第五章 李彦核酸体外扩增及定性检测技术（主讲：李彦）

第五章 核酸体外扩增及定性检测技术 医学检验学院李彦

第五章 医学检验学院 李彦 核酸体外扩增及定性检测技术

章节介绍2学时 1/靶序列扩增 2/探针序列扩增（自学） 3/信号扩增（自学)

章节介绍 2学时 1 靶序列扩增 2 探针序列扩增（自学） 3 信号扩增（自学）

第一节靶序列扩增 01 PCR扩增技术（掌握） 02 其他PCR技术（熟悉） 03 PCR产物分析（了解）

第一节 靶序列扩增 01 PCR扩增技术（掌握） 03 PCR产物分析（了解） 02 其他PCR技术（熟悉）

PCR技术发展史 1953年，Watson 1971年， 和Crick发现 Khorana提出 1985年，MulIis DNA双螺旋结构 PCR理论 体外扩增成功 1958年，Meselson 1976年，钱嘉韵 1988年，Saiki将 和Stahl证明了DNA 分离出耐热 Taq DNA聚合酶 半保留复制 DNA聚合酶 成功应用于PCR

PCR技术发展史 1988年，Saiki将 Taq DNA聚合酶 成功应用于PCR 1953年，Watson 和Crick发现 DNA双螺旋结构 1976年，钱嘉韵 分离出耐热 DNA聚合酶 1958年，Meselson 和Stahl 证明了DNA 半保留复制 1971年， Khorana 提出 PCR理论 1985年，Mullis 体外扩增成功 Meselson￾Stahl

01 二、 基本概念 靶序列扩增(target amplification) 直接扩增靶核酸，使靶序列的拷 贝数增加百万倍，以达到体外对靶 序列进行检测的目的。 wehf,心dut 聚合酶链式反应PCR(polymerase chain reaction) 是模拟生物体内DNA的复制过程， 在体外通过酶促反应合成特异DNA 片段的一种方法

一、基本概念 靶序列扩增（target amplification） 直接扩增靶核酸，使靶序列的拷 贝数增加百万倍，以达到体外对靶 序列进行检测的目的。 聚合酶链式反应 PCR（polymerase chain reaction） 是模拟生物体内DNA的复制过程， 在体外通过酶促反应合成特异DNA 片段的一种方法。 01

二、PCR反应过程（重点） 95℃ DNA单链 变性 72℃ 55℃ DNA双链 延伸 退火 DNA杂交链

二、PCR反应过程（重点） 退火 55℃ DNA杂交链 变性 95℃ DNA单链 延伸 72℃ DNA双链

二、PCR反应过程（重点） 95 互補的雙股DNA序列 70- 60- 田五 35 圖中绿色的部分，是DNA分子中要擴增的片段

二、PCR反应过程（重点）

PCR扩增产物量Y=(1十X)P X→平均每次的扩增效率 平台期 n→循环次数 扩 指数期 增 理论扩增值：以2指数递增，扩增 初期 物 25~30个循环，目标DNA可增加230也 量 就是109倍。 循环次数 实际扩增值：X平均约为75%，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数 一般为106~107

PCR扩增产物量Y=(1＋X)n X 平均每次的扩增效率 n 循环次数 理论扩增值：以2 n指数递增，扩增 25～30个循环，目标DNA可增加2 30也 就是109倍。 实际扩增值：X平均约为75%，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数 一般为106～107 。 扩 增 产 物 量 初期 指数期 平台期

三、PCR反应体系 反应体系 44 模板 |引物 dNTPs DNA聚合酶|缓冲液 要复制的 化学合成的两 dATP、dCTP、 耐热DNA 氯化钾、硫酸 核酸片段 条寡核苷酸 dGTP、dTTP 聚合酶 铵、镁离子

三、PCR反应体系 化学合成的两 条寡核苷酸 引物 dATP、dCTP、 dGTP、dTTP dNTPs 耐热DNA 聚合酶 DNA聚合酶 氯化钾、硫酸 铵、镁离子 缓冲液 反应体系 要复制的 核酸片段 模板

纯度 01 基因组DNA 模板 结构 →(template） 02 RNA→ CDNA 数量 03 质粒DNA或线粒体DNA

模板 （template ） 01 基因组DNA 02 RNA 03 质粒DNA或线粒体DNA cDNA 纯度 结构 数量