《形态学实验》课程教学课件（PPT讲稿）实验七 PCR实验

PCR聚合酶链式反应Chain ReactionPolymerase

聚合酶链式反应 PCR Polymerase Chain Reaction

PCR反应体系的成分及加样程序：编号样品用量（ul)备注(1)双蒸水14.2ul(2)2ulbuffer(3)NTP0.8ul(4)引物0.5ul上、下游引物已混合(5)0.5ulTaqDNA聚合酶用5号管直接加其它各样(6)2ul模板DNA合计20 ul大肠杆菌特异性引物序列：上游引物：5'-GGAGCAAACAGGATTAGATACCC-3下游引物：5'-AACCCAACATTTCACAACACG-3加样完毕后，离心或手指轻弹使溶液完全混匀

PCR反应体系的成分及加样程序： 加样完毕后，离心或手指轻弹使溶液完全混匀。 编号 样品 用量（ul） 备注 （1） 双蒸水 14.2ul   （2） buffer 2ul   （3） dNTP 0.8ul   （4） 引物 0.5ul 上、下游引物已混合 （5） TaqDNA聚合酶 0.5ul 用5号管直接加其它各样 (6) 模板DNA 2ul   合计 20 ul   大肠杆菌特异性引物序列： 上游引物：5'-GGA GCA AAC AGG ATT AGA TAC CC-3' 下游引物：5'-AAC CCA ACA TTT CAC AAC ACG -3

PCR原理及反应参数：95℃4min（预热，激活DNA聚合酶）-95℃30sec（热变性，使模板DNA完全变性成为单链，同时使引物自身和引物之间的发荚结构或局部双链消除：）30个循环58℃30sec退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合）72℃30sec（延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化新生DNA链延伸。）72℃5min（完全延伸）4℃暂时保存扩增总时间为1小时10分钟，电泳时间约为20分钟

PCR原理及反应参数： 95℃ 4min(预热，激活DNA聚合酶） 72℃ 5min(完全延伸） 4 ℃ 暂时保存 95℃ 30sec (热变性，使模板DNA完全变性成为单链，同时使引物 自身和引物之间的发荚结构或局部双链消除；） 58 ℃ 30sec (退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退 火结合） 72℃ 30sec (延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物 催化新生DNA链延伸。） 30个循环 扩增总时间为1小时10分钟，电泳时间约为20分钟

PCR:PolymeraseChainReaction30-40cyclesof3steps:Step 1: denaturationXXXXIXXXXX1minut94°℃Step 2 : annealing45seconds54°℃m3forward and reverse1primers !!!Step3:extension2minutes72°℃onlydNTP's(Andy Vierstracte 1999)

本质：是体外以2n-1方式快速扩增DNA的方法。4thcyclewantedgene=Exponentialamplification3thcycle2nd eyeleC-Istcycle35thcycletemplateDNAm二I二22-35=34billioncopies2copics4copies16copies8copies(AndyVierstracte2001)

本质：是体外以2n-1方式快速扩增DNA的方法

二、PCR在检测病原中的应用由于每种物种都有其特异的DNA序列，针对某物种特异的DNA序列设计引物，使得该引物在PCR反应中只特异地与该DNA序列模板结合，而不与其他DNA序列结合，从而扩增该DNA序列。通过检测扩增产物中是否获得该特异的DNA片段，来判断样本中是否含有该物种成分。因此，PCR在临床上可以用于病原体的检测，包括患者是否受到某种病原体的感染，食物中各种微生物是否含有或超标。可用PCR检测的病原体包括各种细菌、病毒、沙眼衣原体、支原体、寄生虫等

由于每种物种都有其特异的DNA序列，针对某物种特 异的DNA序列设计引物，使得该引物在PCR反应中只特异地 与该DNA序列模板结合，而不与其他DNA序列结合，从而扩 增该DNA序列。通过检测扩增产物中是否获得该特异的DNA 片段，来判断样本中是否含有该物种成分。 因此，PCR在临床上可以用于病原体的检测，包括患 者是否受到某种病原体的感染，食物中各种微生物是否含 有或超标。可用PCR检测的病原体包括各种细菌、病毒、 沙眼衣原体、支原体、寄生虫等。 二、PCR在检测病原中的应用

本次实验使用的引物是针对大肠杆菌16SrDNA基因中的保守序列设计的，序列如下：ggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaagttttcagagatgagaatgtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggtt扩增产物大小为：323bp

扩增产物大小为： 323bp 本次实验使用的引物是针对大肠杆菌16S rDNA基因中的保守序列设计的，序列如下： ggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgt cgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgtt aagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatga attgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatg caacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaagttttcagag atgagaatgtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtc gtcagctcgtgttgtgaaatgttgggtt

三、PCR产物的凝胶电泳检测PCR产物电泳的依据：DNA模板经PCR扩增后，获得大量相同大小的双链DNA，与溴化乙啶（EB）或替代品嵌合后，与上样液（Ioadingbuffer）混合后，其混合液密度大于电泳液的密度，加于预先做好的琼脂糖（1%）凹形孔中，在电场力的作用下，带负电的DNA在琼脂糖中进行泳动。琼脂糖凝胶可充当固相介质。其结构为网格样的立体结构对双链DNA的分离起到分子筛作用。琼脂糖浓度越大，其网格样结构越小、越致密：琼脂糖浓度越小，其网格样结构越大、越疏松。在电场力的作用下，DNA片段在琼脂糖的立体网格样结构中呈“Z”型泳动。在电压一定的情况下，DNA片段越大，泳动的越慢，DNA片段越小，泳动的越快，从而达到分离DNA的功能

PCR产物电泳的依据： DNA模板经PCR扩增后，获得大量相同大小的双链DNA，与 溴化乙啶（EB）或替代品嵌合后，与上样液（loading buffer)混合后，其混合液密度大于电泳液的密度，加于 预先做好的琼脂糖（1%）凹形孔中，在电场力的作用下， 带负电的DNA在琼脂糖中进行泳动。 琼脂糖凝胶可充当固相介质。其结构为网格样的立体结构， 对双链DNA的分离起到 分子筛作用。琼脂糖浓度越大，其 网格样结构越小、越致密；琼脂糖浓度越小，其网格样结 构越大、越疏松。在电场力的作用下，DNA片段在琼脂糖 的立体网格样结构中呈“Z”型泳动。在电压一定的情况 下，DNA片段越大，泳动的越慢， DNA片段越小，泳动的 越快，从而达到分离DNA的功能。 三、PCR产物的凝胶电泳检测

常用的EB替代品有Gillgreen或Goldview是一种新型的聚次甲基染料，其不能穿透细胞膜，但可以和游离的DNA高效结合，是一种高灵敏的核酸染料，GoldVit核酸彩与EB染料灵敏度相当。不具有致癌毒iNetE性，是一种安全的核酸染料。废弃的Gillgreen在环境下会自然分解，因此无需特殊处理

常用的EB替代品有Gill green或Gold view是一种新型的聚次甲基染料，其 不能穿透细胞膜，但可以和游离的DNA 高效结合，是一种高灵敏的核酸染料， 与EB染料灵敏度相当。不具有致癌毒 性，是一种安全的核酸染料。废弃的 Gill green在环境下会自然分解，因 此无需特殊处理

DNAMarker的作用在实验中如果在待检孔的旁边加入已知大小的DNAMarker作为测量待检样DNA的标尺，就可知道待检DNA片段的大小。将该DNA的大小与预期值进行比较，从而判定待检样本中是否含有自标DNA，即可用于特异病原等方面的诊断。146M1M22357

DNA Marker的作用 在实验中如果在待检孔的旁边加入已知大小的DNA Marker作为测量待检样DNA的标尺，就可知道待检DNA片 段的大小。将该DNA的大小与预期值进行比较，从而判定 待检样本中是否含有目标DNA，即可用于特异病原等方面 的诊断