重庆医科大学：《免疫学实验》课程教学课件（PPT讲稿）实验四 免疫酶斑点试验Dot-ELISA

免疫酶斑点试验Dot-ELISA

免疫酶斑点试验 Dot-ELISA

实验目的1.了解免疫酶斑点技术的基本原理及方法；2.了解免疫酶斑点技术的用途

实验目的 2.了解免疫酶斑点技术的用途。 1.了解免疫酶斑点技术的基本原理 及方法；

免疫斑点酶技术的原理硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力,在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。将免疫物质吸附于纤维素膜后，可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应

免疫斑点酶技术的原理 硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强 的静电吸附力, 在中性条件下即可有效 地吸附蛋白质等生物大分子。 将免疫物质吸附于纤维素膜后，可利用 纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应

直接法DOT-ELISA间接法DOT-ELISAH.PEE酶标记已知特异性抗体酶标记抗-抗体

免疫酶斑点技术的特点1.Ag-Ab反应一高特异性2.酶催化作用的高效性一高敏感性3.NC膜的运用一微量抗原的检测

免疫酶斑点技术的特点 1. Ag-Ab反应—高特异性 2. 酶催化作用的高效性—高敏感性 3. NC膜的运用—微量抗原的检测

实验方法及注意事项1.分组为单位（2-3人为一组);2.膜片、抗原、洗涤液、吸水纸在实验台上3.酶标抗体放置在冰箱，使用前取出；4.底物临用前配置：5.震荡器全班一台，调整好频率后不要乱动

1. 分组为单位 (2-3人为一组)； 实验方法及注意事项 2. 膜片、抗原、洗涤液、吸水纸在实验台上； 3. 酶标抗体放置在冰箱，使用前取出； 4. 底物临用前配置； 5. 震荡器全班一台, 调整好频率后不要乱动

方法(直接法)1.取硝酸纤维素膜片，用笔做好标记方便加样2.将稀释的抗原液2-5u加于相应格内,室温自然干燥！3.将膜片放入封闭液中震荡封闭15分钟4.用洗涤液震荡洗3次，每次1分钟，吸干；5.将膜片放入稀释好的酶标抗体液体中，震荡15分钟,吸干；6.将膜片放入洗涤液中，震荡涤洗3次×1分钟吸干;7.将膜片放入底物液中，震荡5分钟左右观察明显棕色斑点者为阳性

方法(直接法) 1. 取硝酸纤维素膜片, 用笔做好标记方便加样; 2. 将稀释的抗原液2-5μl加于相应格内,室温自然 干燥! 3. 将膜片放入封闭液中震荡封闭15分钟; 4. 用洗涤液震荡洗3次, 每次1分钟, 吸干; 5. 将膜片放入稀释好的酶标抗体液体中，震荡 15分钟, 吸干; 6. 将膜片放入洗涤液中, 震荡涤洗3次×1分钟, 吸干; 7. 将膜片放入底物液中, 震荡5分钟左右观察。 明显棕色斑点者为阳性

实验结果阴性阳性

实验结果

免疫斑点试验的影响因素1显色时间，一般认为5~10分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。2.用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般2~5叫l即可

1. 显色时间，一般认为5~10分钟较好。 显色时间过长常导致本底着色加深，降低 试验的特异性。 2. 用抗原包被NC检测抗体时，待检样品 加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品 混淆，一般2~5μl即可。 免疫斑点试验的影响因素

免疫酶斑点技术的应用1.微量抗原的检查；2.抗体分泌细胞、细胞因子产生细胞的筛选;3.自身抗体的检查

免疫酶斑点技术的应用 1. 微量抗原的检查; 2. 抗体分泌细胞、细胞因子产生细胞 的筛选; 3. 自身抗体的检查