重庆医科大学：基础医学实验教学课件（PPT讲稿）限制性酶切与琼脂糖凝胶电泳

分子生物学实验技术DNA限制性内切酶酶切与琼脂糖凝胶电泳

DNA限制性内切酶酶切 与琼脂糖凝胶电泳 分子生物学实验技术

一、实验目的了解限制性内切酶的概念及其应用。掌握DNA酶切的基本原理和实验方法掌握酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法

一、实验目的 ➢ 了解限制性内切酶的概念及其应用。 ➢ 掌握DNA酶切的基本原理和实验方法。 ➢ 掌握酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测方 法

二、实验原理限制性内切酶概念1、>是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。>是基因工程的重要工具。>这些酶都是从原核生物中发现。它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭

二、实验原理 ➢是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA 水解酶。 ➢是基因工程的重要工具。 ➢这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似 高等功物的免疫系统， 用于抗击外来DNA的侵袭。 1、限制性内切酶概念

2、举例：EcoRI的识别序列5'- GAATTC-33'- CTTAAG-5HaeI的识别序列5'- GTTAAC-33'-CAATTG-5

5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 2、举例：

5'NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN33'NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN55'NNNNNGPAATTCNNNNNN33'NNNNNCTTAAPGNNNNNN5EcoRI的识别序列和酶切切口（粘端）

5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3' GNNNNNN5’

5'NNNNNNGTTAACNNNNN33'NNNNNNCAATTGNNNNN55'NNNNNGTTPAACNNNNN33'NNNNNCAApTTGNNNNN5HaeI的识别序列和酶切切口（平端）

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）

三、实验仪器和试剂仪器：恒温水浴锅★电泳相关仪器：微波炉、水平式凝胶电泳槽★电泳仪、紫外投射仪微量加样器和吸头Eppendorf管★

三、实验仪器和试剂 仪器： ★ 恒温水浴锅 ★ 电泳相关仪器：微波炉、水平式凝胶电泳槽、 电泳仪、紫外投射仪 ★ 微量加样器和吸头 ★ Eppendorf管

试剂：★酶切相关试剂：>纯化质粒pTA2-p53质粒（200ng/μI）>限制性内切酶：EcoRI（8-20U/μ1）>10×酶切缓冲液电泳相关试剂★>琼脂糖>1XTBE缓冲液>DNA分子量标准>GoldView（25X贮存液）>6×上样缓冲液

试剂： ★ 酶切相关试剂： ➢纯化质粒pTA2-p53质粒（200ng/μl） ➢限制性内切酶：EcoR Ⅰ（8-20U/ μl ） ➢10×酶切缓冲液 ★ 电泳相关试剂 ➢琼脂糖 ➢1 ×TBE缓冲液 ➢DNA分子量标准 ➢GoldView（25×贮存液 ） ➢6 ×上样缓冲液

oriBlacAmpKpnlEcoRIpTA2-p53p53gene:1179bpp53geneEcORI3956bpSacllacpromoterpUCoriApalHine llDra llBsp1061AccIT7PromoterBssHIIClaIHindlllEcoRVKpnIEcoO109IXhoISallM13-20primerbindingsiteKS primerbinding siteT7 primer binding site5'TTGTAAAAOGACGGOCAGTGAGOGOGOGTAATAOGACTCACTATAGGGOGAATTGGGTACCGGGOOOOOOCTOGAGGTOGAOGGTATCGATAAGCTTGATAT3'AACATTTTGCTGOOGGTCACTCGOGOGCATTATGCTGAGTGATATOOOGCTTAACOCATGGOOOGGGGGGGAGCTOCAGCTGOCATAGCTATTCGAACTATAEcoRI PstEcORISmaIBamHlSpeIXbaTNotIBstXISaelSacIEaglCGAATTCOOATACT3TATTGGGAATTOOGCAGOOGGGGGATOCACTAGITCTAGAGOGOOOGOCAOGOGGTGGAGCTO(al oned insert)3TCTATGCCTTAAGGGATAACOCTTAAGGCGTOGGGOOOCCTAGGTGATCAAGATCTCGOOGGOGGTGGOGOCACCTOGAGGSK primerbinding site

p53 gene: 1179bp

琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖简介快速、最常用琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、的分离纯化和鉴定核酸的方法；

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