海南大学：《基因工程》课程教学资源（PPT课件）第6章 大分子的分离与分析 第3节 分子杂交

第三节 分子杂交 分子杂交是基因操作中常用来检测混合样品中是否含有目 的基因或蛋白质的一种分析方法。 根据检测对象不同分为： Southern:杂交：检测DNA、探针为DNA或RNA Northern杂交：检测RNA、探针为DNA、cDNA DNA DNA Western:杂交：检测蛋白、探针为抗体 二抗一酶E 一抗一酶E▲ 蛋白质 DNA或CDNA RNA

第三节 分子杂交 分子杂交是基因操作中常用来检测混合样品中是否含有目 的基因或蛋白质的一种分析方法。 根据检测对象不同分为： Southern杂交：检测DNA、探针为DNA或RNA Northern杂交：检测RNA、探针为DNA、cDNA Western杂交：检测蛋白、探针为抗体 RNA DNA DNA RNA 蛋白质

核酸分子杂交(nucleic acid hybridization.) 指核酸变性后，具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下 按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的 双链分子杂交分子。 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知 核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合， 再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示 出来。 由于western杂交与核酸杂交的相似性，因此也归入分子杂交

指核酸变性后，具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下 按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的 双链分子-杂交分子。 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知 核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合， 再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示 出来。 由于western杂交与核酸杂交的相似性，因此也归入分子杂交 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）

按样品制备过程划分 1) 原位杂交(in situ hybridization) 1.原位菌落杂交 ⅱ.原位噬菌斑杂交 ii.原位细胞杂交 iv.原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA,RNA或蛋白质样品，可 同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或 组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2)斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA,RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在 固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小

1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可 同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或 组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2）斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在 固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。 按样品制备过程划分

3)转移杂交或印迹杂交(blotting hy bridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体 基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于 转移的方法有： i1.扩散法 ii.毛细管法 iii.电泳转移法 v.真空转移法 4)夹心杂交法(sandwich hybridization) 它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带 标记的探针固定在基质上，然后用待测样品 与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二 种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制 DNA样品，可检测出O.2ng的DNA样品

3）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体 基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于 转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization) * 它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带 标记的探针固定在基质上，然后用待测样品 与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二 种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制 DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品

Southern杂交 这种方法是E.M.Southern1975年建立，是进行基因组 DNA特定序列定位的通用方法。 宁大学聘请MS吐cm先生为名营教板

这种方法是E.M.Southern1975年建立,是进行基因组 DNA特定序列定位的通用方法。 一、Southern杂交

(一)、基本原理 DNA复性动力学基本原理设计 在一定条件下发生变性的DNA分子，恢复条件后又能通过 碱基互补配对的方式重新结合形成双链DNA分子。 Optical density 1.5 1.4 1.3 两条链分开 1.2 1.1 30 50 70 Tm9095100110[c]

DNA复性动力学基本原理设计 在一定条件下发生变性的DNA分子，恢复条件后又能通过 碱基互补配对的方式重新结合形成双链DNA分子。 （一）、基本原理

single-strandod DNA probes mixture of single-stranded ONA molecules hybridization in hybridization in 50%formamide 50%formamide 就42℃ at35℃ only A forms stable A.C.and E all form double helix stable double helices STRINGENT REDUCED-STRINGENCY HYBRIDIZATION HYBRIDIZATION

(二)、基本步骤 和奏 1、待测核酸样品的制备 ①裂解或破碎细胞 ②抽取纯化基因组DNA ③限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 限制性酶必须选择在探针分子中没有识别位点的酶才 能真实体现目的基因在基因组的分布水平

（二）、基本步骤 1、待测核酸样品的制备 ①裂解或破碎细胞 ②抽取纯化基因组DNA ③限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 限制性酶必须选择在探针分子中没有识别位点的酶才 能真实体现目的基因在基因组的分布水平

稻奏 切点位于探针外 单拷贝 切点位于探针内 两拷贝

A 单拷贝 两拷贝 切点位于探针外 切点位于探针内

2、待测DNA样品的电泳分离 ①琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 ②凝胶电泳： 凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢，小分子DNA泳动快， 大小相同的分子处于同一条带 ③分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA,杂交 所用分子量标准可用同位素标记

①琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 ②凝胶电泳： 凝胶具有分子筛效应,大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小相同的分子处于同一条带 ③分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用同位素标记 2、待测DNA样品的电泳分离