海南大学：《基因工程》课程教学资源（PPT课件）第6章 大分子的分离与分析 第4节 RNA作图和端点分析

第四节RNA作图和端点分析 作用： 分析真核生物基因组结构 分析真核生物基因组中内含子的剪切 分析真核基因转录的第一个碱基

第四节 RNA作图和端点分析 作 用： 分析真核生物基因组结构 分析真核生物基因组中内含子的剪切 分析真核基因转录的第一个碱基

真核生物mRNA的修饰加工 和奏 Ovalbumin gene 7,700bp 1 2 34 56 DNA A B CD E F G Transcription and 5'capping Extra RNA 12 3 5 6 Primary E F G transeript Cap Splicing,cleavage, and polyadenylation Seven introns Extra RNA L123456 Mature mRNA AAA(A) 1,872 nucleotides

真核生物mRNA的修饰加工

S1核酸酶 单链核酸内切酶、降解单链DNA或RNA 去掉双链中未杂交的单链 对双链DNA、RNA或两者的杂交体不敏感。 辅助因子：Zn

S1核酸酶 单链核酸内切酶、降解单链DNA或RNA 去掉双链中未杂交的单链 对双链DNA、RNA或两者的杂交体不敏感。 辅助因子：Zn

S1核酸内切酶的功能 (1)催化单链RNA或DNA降解。 (2)切掉双链核酸中的单链区。 发卡或有缺口的部位。 S1 S1

S1核酸内切酶的功能 （1）催化单链RNA或DNA降解。 （2）切掉双链核酸中的单链区。 S1 S1 发卡或有缺口的部位

甚至能识别单个核苷酸的单链区 TACGTA CGTACG ATGCAT GCATGC (3) 降解限制酶切形成的单链突出端。 (4)不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链

（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链 ATGCAT GCATGC TACGTA CGTACG T 甚至能识别单个核苷酸的单链区！ （3）降解限制酶切形成的单链突出端

S1核酸酶的用途 (1)定位RNA 某限制酶位点（参照物） DNA 某限制酶切后再与RNA杂交 RNA S1 RNA S1 200bp 400bp 内切酶位点不能位于内含子序列中！

S1核酸酶的用途 （1）定位RNA DNA RNA S1 S1 200bp 400bp 某限制酶切后再与RNA杂交 某限制酶位点（参照物） 内切酶位点不能位于内含子序列中！ RNA

RNA位置 RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。 (2) 用mRNA测定基因中的外显子序列 不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。 DNA mRNA

RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。 RNA位置 不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。 mRNA DNA （2）用mRNA测定基因中的外显子序列

RNA的S1核酸酶作图 分离待分析mRNA的基因组DNA-=-标记- mRNA杂交-S1核酸酶消化杂合体-凝胶和 变性凝胶电泳分离一根据分离带的大小推断 外显子的大小和位置

一、RNA的S1核酸酶作图 分离待分析mRNA的基因组DNA-标记- mRNA杂交-S1核酸酶消化杂合体-凝胶和 变性凝胶电泳分离-根据分离带的大小推断 外显子的大小和位置

E E2 ds-DNA 变性 基因转录 E2 SS-DNA nnnn mRNA [杂交 DNA.RNA杂交分子 ExoVII 凝胶电泳 碱解 碱解 电泳 E1+E2 电泳 E2 E1+I+E2

ds-DNA E1 I E2 变性 基因转录 S1 ExoVII 凝胶电泳 碱解 电泳 碱解 E1+E2 电泳 E1 E2 E1+I+E2 SS-DNA 杂交 E1 E2 mRNA DNA.RNA杂交分子

二、S1核酸酶作图分析mRNA的端点 预测mRNA的端点-设计覆盖端点的寡核苷酸- -末端标记-杂交S1核酸酶水解-凝胶检 测推断端点序列 RE 转录 分离小片段，变性 5'3' 杂交 化学法定序 3 3-端第一个n.t SS-DNA 碱解

二、S1核酸酶作图分析mRNA的端点 预测mRNA的端点-设计覆盖端点的寡核苷酸- -末端标记-杂交-S1核酸酶水解-凝胶检 测-推断端点序列 + 杂交 S1 SS-DNA 碱解 3'-端第一个n.t. 化学法定序 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3