《环境分子生物学》课程教学课件（讲稿）第5章 环境分子生物学常用技术 5-2 分子生物学-定量PCR，FISH

2.2.5实时荧光定量PCR技术主要内容Real Time PCR基础知识Real TimePCR实验方法RealTimePCR解析方法

主 要 内 容 1 Real Time PCR基础知识 2 Real Time PCR实验方法 3 Real Time PCR解析方法 2.2.5 实时荧光定量PCR技术 3

引物5'3'3'5'变性、退火延伸延伸变性、退火PCR的指数扩增（2n）

PCR的指数扩增（2 n） 引物 延伸 延伸 5’ 3’ 5’ 3’ 变性、退火 变性、退火 4

First CycleThird CycleSecond CycleMelt Anneal ReplicateMelt Anneal ReplicateMelt Anneal ReplicateTemperatureunTime

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PCR过程的实时监测理论值，指数增长期VNA 607实际值，平台期循环数#平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等

 指数增长期  平台期 循环数 # 理论值 实际值 Log 产物DNA PCR过程的实时监测 平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量 越多，平台出现得越早。 平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变 性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等 6

Real Time PCR的原理使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。发射光享宫Ct值

Real Time PCR的原理 激 发 光 发 射 光 使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。 Ct值 7

扩增曲线：四个阶段线性图谱平台期线性增长期指数增长期基线期平台期对数图谱线性增长期指数增长期基线期

扩增曲线：四个阶段 线 性 图 谱 对 数 图 谱 平台期 线性增长期 指数增长期 基线期 平台期 线性增长期 指数增长期 基线期

荧光定量PCR数学原理基线→阈值→Ct值［DNA]1.9end1.8-point1.7PCR1.6-1.5-1.4-1.31.21.1-n1-0.9-00.8-0.7-0.60.5-0.4-0.3-0.2Log0.1-phase0PCR0202510303540Cycle Number

荧光定量PCR数学原理 基线 阈值 Ct值 [DNA]0

基线→值→Ct值→[DNA]什么是基线？基线就是扩增曲线中的水平部分212723242521-723334evcNumeeNumt对数图谱线性图谱

什么是基线？ 基线就是扩增曲线中的水平部分。 线性图谱 对数图谱 基线 阈值 Ct值 [DNA]0

基线→值→Ct值→[DNA]什么是阈值？1基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。2.偶然误差的结果满足对数分布。3.阅值=基线（背景）信号标准偏差x104.由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10一55.当荧光信号大于阅值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。8.884.0000.002.00.005阅值基线标准偏差

什么是阈值？ 1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。 基线 阈值 Ct值 [DNA]0

基线→阈值～Ct值→［DNA]什是CT值?从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数线性图谱对数图谱C-值C值

什是C T值？ 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 线性图谱 对数图谱 CT值 CT值 基线 阈值 Ct值 [DNA]0