《分子生物学》课程教学资源（PPT课件）基因组文库的构建与基因分离、cDNA文库的构建与筛选

第二节基因组文库的构建与基因分离 基因组文库( genomic ibrary) 基因组文库:将某一生物基因组DNA片段化并全 部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲,这些 重组载体上带有了该生物体的全部基因。 操作:将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成 大小合适的片断,并将所有这些片断都与适当的载体连 接,引入相应的宿主细胞中保存和扩增

基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全 部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些 重组载体上带有了该生物体的全部基因。 操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成 大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连 接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 第二节基因组文库的构建与基因分离 基因组文库（genomic library）

按外源DNA片段的来源分基因文库分为 基因组DNA文库 从特定组织提取的染色体基因组DNA CDNA文库 mRNA反转录成的cDNA拷贝 Genomic Library Bacteria digestion Restriction digestion 8 Restriction DNA Library digestion Ligation o Bacteria Restriction Ligation mRNA CDNA 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成

基因组DNA文库 从特定组织提取的染色体基因组DNA cDNA文库 mRNA反转录成的cDNA拷贝 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 按外源DNA片段的来源分基因文库分为

构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建 完整的基因文库所需要的重组子的数目。 (1)对载体的要求 载体容量越大,所要求的DNA片断数目越少 所需的重组子越少。 (2)目前常用的载体 λ载体系列:容量为23kb cosmid载体:容量为45kb YAC 容量为1Mb BAC. 容量为300kb

载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建 完整的基因文库所需要的重组子的数目。 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少， 所需的重组子越少。 载体系列： 容量为 23 kb cosmid载体： 容量为 45 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb 构建基因文库的载体选用 （1）对载体的要求 （2）目前常用的载体

基因组文库应满足的条件 1、文库的完整性: 文库应包含基因组的完整序列信息 2、基因组信息的可重建性: 重建基因组的完整信息 3、文库的大小: 即文库中应包含的独立重组子数目

1、文库的完整性： 文库应包含基因组的完整序列信息 2、基因组信息的可重建性： 重建基因组的完整信息 3、文库的大小： 即文库中应包含的独立重组子数目 基因组文库应满足的条件

基因组文库的大小 理论值: 基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长 /DNA插入片段的平均长度。 例如: 细菌基因组DNA总长度=46×10kb 酶切后的DNA片段平均长度=15kb 基因组文库的克隆数=46×10kb/15kb 31×105个克隆

理论值: 基因组文库的克隆数目＝基因组DNA总长 /DNA插入片段的平均长度。 例如： 细菌基因组DNA总长度=4.6 × 106kb 酶切后的DNA片段平均长度= 15kb 基因组文库的克隆数= 4.6 × 106kb/ 15kb= 3.1 × 105个克隆 基因组文库的大小

经验值: N In(1-P) N=461 In(1-L/G P:文库包含了整个基因组DNA的概率(99% L:克隆 fragment的平均大小 G: Genome大小 N:所需的重组载体数(克隆数)

N= ln (1-P) ln (1-L/G) P：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） L：克隆fragment的平均大小 G：Genome大小 N：所需的重组载体数（克隆数） N= 4.61× G L 经验值：

For example 期望值为0.99,插入片断为20kb的Ecoi(46×106 bp)和 human(3×109bp)基因组的克隆数的计算 in(1-0.99) N E coli =1.1×103 n[1-(2×10446×10 ln(1-0.99) mn1(2×10/3×10 6.9×10 这个例子说明用质粒载体(插入片断5-10kb)就可以建立 很好的原核生物基因文库,只需要几千个克隆;而真核生物 则需要更大承载能力的载体

ln( 1-0.99) ln[1-(2×104 /4.6×106 )] Nhuman= = 6.9 ×105 ln(1-0.99) ln[1-(2 ×104 /3 ×109 )] 这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb ）就可以建立 很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物 则需要更大承载能力的载体。 NE.coli= ＝1.1 ×103 For example : 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6×106 bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算

例如:人的基因组是3×109bp,插入DNA 片断的平均长度如果是1.7×104bp 所需的重组载体数 N=461X=461 3×109 1.7×10 8.1×10 基因组文库实际克隆数:比计算值大2倍或3倍, 或更高

例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA 片断的平均长度如果是1.7×104 bp， 所需的重组载体数： N= 基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或3倍， 或更高 4.61× G f =4.61× 3×109 1.7×104 = 8.1×105

、基因组DNA文库的构建 基因组文库应具有的克隆子数 基因组大小vbp 克隆片段 平均大小2×10(细菌)2×107(真菌) 2×109(动物) (bp) 理论克实际克隆理论克隆 隆数 数 数 实际克隆数理论克隆数实际克隆数 5×103 400 1831 4000 18418 600000 2763110 10×103 200 919 2000 9208 300000 1381550 20×103 100 458 1000 4603 150000 690774 40×103 50 278 500 2300 75000 345386

一、基因组DNA文库的构建 克隆片段 平均大小 （bp） 基因组大小/bp 2×106（细菌） 2×107 （真菌） 2×109（动物） 理论克 隆数 实际克隆 数 理论克隆 数 实际克隆数 理论克隆数 实际克隆数 5×103 400 1831 4000 18418 600000 2763110 10×103 200 919 2000 9208 300000 1381550 20×103 100 458 1000 4603 150000 690774 40×103 50 278 500 2300 75000 345 386 基因组文库应具有的克隆子数

基因组文库构建的一般步骤 1、染色体DNA的分离 Bacteriophage入DNA Human DNA 49 kb (310sbp》 Replaceable egic 3、载体的制备 Cut with BarnHI 2、大片段的制备 Partial digestion Remove replaceable with sau3A into region 20-kb fragments Discard》 III 20-kb fragment A vector arms with sticky ends with sticky ends Mix human DNA fragments 4、重组连接 and arms Seal with DNA ligase l Recombinant 2 DNA of size that can be packaged 5、包装 Package with in vitro phage-assembly system 6、重组噬菌体 坚大→基交

1、染色体DNA的分离 2、大片段的制备 3、载体的制备 4、重组连接 5、包装 6、重组噬菌体 感染大肠杆菌 基因组文库 基因组文库构建的一般步骤