西安电子科技大学：《基因工程》课程教学资源（PPT课件讲稿）第二章 基因工程的酶学基础 第一节 限制性核酸内切酶

第二章基因工程的酶学基础 第一节限制性内切酶 第二节DNA连接酶 第三节DNA聚合酶和反转录酶 第四节DNA修饰酶 第五节外切核酸酶 第六节单链內切核酸酶 第七节RNA酶

第二章 基因工程的酶学基础 第一节 限制性内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 外切核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 第七节 RNA酶

基本概念及其生物功能 核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键,从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。 根据作用的核酸底物不同 特异水解断裂RNA分子,核糖核酸酶( RNase) 特异水解断裂DNA分子,脱氧核糖核酸酶( DNase) 非专一性酶,底物或者为DNA或者为RNA 按水解断裂核酸分子的方式 从核酸分子末端逐个降解核苷酸,叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段,叫内 切核酸酶

核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。 基本概念及其生物功能 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA 从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内 切核酸酶 • 按水解断裂核酸分子的方式: • 根据作用的核酸底物不同:

工具酶 基因工程的操作,是在分子水平上的 操作,是依赖一些酶(如限制性核酸內切酶, 连接酶,DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割,拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶

基因工程的操作，是在分子水平上的 操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶， 连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶” 。 工具酶

第一节限制性核酸內切酶 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、山型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用

1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 第一节 限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶概念 限制性内切核酸酶( Restriction endonuc ease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp), 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶

限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)， 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 限制性核酸内切酶概念

1来源主要来源于原核生物 2.性质内切酶 即在核酸分子链的內部制造切口的酶。 形成5P和3-0H末端 3功能自我保护作用 细菌的限制和修饰系统(RM体系) 任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制

2. 性质 内切酶 主要来源于原核生物 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端 3. 功能 自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系） 1. 来源 任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制

寄主的限制与修饰现象 E.0.P成斑率 efficiency of plating phageλ(B) EOP=1 E0P=104(限制作用) 大肠杆菌B →大肠杆菌K E0P=104(限制作用) E0P=1(修饰作用) 修饰的 phageλ(K 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所 谓的寄主控制的限制与修饰现象简称(R/M体系)。细菌的RM体系类 似于免疫系统,能辨别自身的DN与外来的DNA,并能使后者降解掉

大肠杆菌B 大肠杆菌K phage λ (B) EOP=10-4（限制作用） EOP=10-4（限制作用） EOP=1（修饰作用） 修饰的phage λ (K) 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所 谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类 似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。 寄主的限制与修饰现象 E.O.P 成斑率 efficiency of plating EOP=1

(1)限制( Restriction) 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解,切成小片断。 Restrictio anzyme EcoRI Unmethylated 5 □3 DNA 5 Sticky ends 5[G AATTO口3 3 CTTAA G□5 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA, 维护宿主遗传稳定的保护机制

限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解，切成小片断。 （1）限制（Restriction） 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA， 维护宿主遗传稳定的保护机制

(2)修饰( Modification 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ①Dam甲基化酶( DNA Adenine Methy lase) GATG腺嘌呤№6位置引入甲基 ②Dcm甲基化酶( dna cytosine Methy lase) CCAGG或cCTG序列在第二个G上0位置上 引入甲基 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传物质的目的

细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 （2）修饰（Modification） ① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C 5位置上 引入甲基 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传物质的目的

ECORI methylase Unmethylated 5 aGAAT T CE 3 DNA 3 C T AAG 5 Restriction enzyme ECORI EcoRl will not cleave methy lated DNA Methylated5′ 3 DNA GA C 3 CTTAAG CH