延安大学基础医学实验教学示范中心：《细胞生物学》实验课教学课件_实验三 细胞骨架标本的制备及观察

实验三 细胞骨架标本的制备及观察

实验三 细胞骨架标本的制备及观察

、实验目的 ·1.掌握细胞骨架的显示方法的原理。 2.熟悉光学显微镜下细胞骨架的基本形态结构。 ·3.了解细胞骨架标本的制备方法

一、实验目的 • 1. 掌握细胞骨架的显示方法的原理。 • 2．熟悉光学显微镜下细胞骨架的基本形态结构。 • 3. 了解细胞骨架标本的制备方法

、实验材料 ·洋葱鳞茎、光学显微镜、水浴箱、载玻片、盖玻 片、吸管、培养皿、青霉素小瓶、镊子、剪子、 擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、pH72PBS (无钙镁磷酸缓冲液)、pH6.5PBS、M-缓冲液 (10×原液)、1% TritonX-100、2% TritonX 100、3%戊二醛液、0.2%考马斯亮兰染液

二、实验材料 • 洋葱鳞茎、光学显微镜、水浴箱、载玻片、盖玻 片、吸管、培养皿、青霉素小瓶、镊子、剪子、 擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、pH7.2 PBS （无钙镁磷酸缓冲液）、pH6.5 PBS、M-缓冲液 （10×原液）、1% TritonX-100、2%TritonX- 100、3%戊二醛液、0.2%考马斯亮兰染液

、实验原理 ·细胞骨架是真核细胞内由蛋白质纤维构成的网络结构。当 用适当浓度的 Tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚,是 种非离子去垢剂)处理细胞时,可将质膜中及细胞内许多 蛋白质溶解,而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏,经固 定和考马斯亮兰(非特异性蛋白质染料)染色后,可使细 胞骨架蛋白着色而显示骨架显微结构。由于骨架系统中有 些纤维(如微管)在该实验条件下不够稳定,而有些类型 的纤维太细,在光镜下无法分辨,因此显示看到的主要是 微丝组成的微丝束。采用活体染色等方法制备细胞骨架标 本,加强动手能力和了解临时制片的方法

三、实验原理 • 细胞骨架是真核细胞内由蛋白质纤维构成的网络结构。当 用适当浓度的TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚，是一 种非离子去垢剂）处理细胞时，可将质膜中及细胞内许多 蛋白质溶解，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏，经固 定和考马斯亮兰（非特异性蛋白质染料）染色后，可使细 胞骨架蛋白着色而显示骨架显微结构。由于骨架系统中有 些纤维（如微管）在该实验条件下不够稳定，而有些类型 的纤维太细，在光镜下无法分辨，因此显示看到的主要是 微丝组成的微丝束。采用活体染色等方法制备细胞骨架标 本，加强动手能力和了解临时制片的方法

四、实验方法 1.洋葱鳞茎表皮细胞细胞骨架标本制备 (1)撕取约5×5mm大小的洋葱鳞茎中层鳞片的 内表皮,浸入pH65PBS中5min后,再放入盛有 2% Tritonx-100液的小瓶中,37℃处理20~30min, 以溶解掉细胞骨架以外的蛋白质。 ·(2)用吸管吸尽2% TritonX-100液,加入M缓冲 液洗涤2~3次,每次5min,以使细胞骨架稳定

四、实验方法 • 1. 洋葱鳞茎表皮细胞细胞骨架标本制备 • （1） 撕取约5×5mm大小的洋葱鳞茎中层鳞片的 内表皮，浸入pH6.5 PBS中5min后，再放入盛有 2%TritonX-100液的小瓶中，37℃处理20～30min， 以溶解掉细胞骨架以外的蛋白质。 • （2）用吸管吸尽2%TritonX-100液，加入M-缓冲 液洗涤2～3次，每次5min，以使细胞骨架稳定

四、实验方法 (3)吸弃M缓冲液,加人3%戊二醛固定液,固 定10min,再用PBS洗2~3次,每次3min。 (4)吸尽缓冲液,加0.2%考马斯亮兰染液,染 色8~10min,再用PBS洗2~3次,每次3min。 (5)取出洋葱鳞茎表皮,平展于载玻片上,盖上 盖玻片即可观察

四、实验方法 • （3）吸弃M-缓冲液，加人3%戊二醛固定液，固 定10min，再用PBS洗2～3次，每次3min。 • （4）吸尽缓冲液，加0.2%考马斯亮兰染液，染 色8～10min，再用PBS洗2～3次，每次3min。 • （5）取出洋葱鳞茎表皮，平展于载玻片上，盖上 盖玻片即可观察

五、结果与分析 光镜下可见洋葱鳞茎表皮细胞的胞质着色极淡, 其中被染成深蓝色的网状结构即为细胞骨架 微丝,有的细胞中在核的周围还可见有些放射状 分布的细丝

五、结果与分析 • 光镜下可见洋葱鳞茎表皮细胞的胞质着色极淡， 其中被染成深蓝色的网状结构即为细胞骨架—— 微丝，有的细胞中在核的周围还可见有些放射状 分布的细丝

六、作业 1.细胞骨架显示方法的原理是什么? 2.绘制细胞骨架显微图

六、作业 • 1. 细胞骨架显示方法的原理是什么？ • 2. 绘制细胞骨架显微图