《植物生物学》课程教学资源（实验讲义）实验十八 植物化学分类学中层析法的应用

18植物化学分类学中层析法的应用植物化学分类学（Chemotaxonomy）诞生于20世纪60年代，是一门新兴的边缘学科，该学科以化学为手段，以分类学为研究的最终目的。植物化学分类学不仅在分子水平上提供分类学特征，而且还研究物种的系统发育在分子水平上所反映的规律性。该学科的主要任务为：探索各分类阶元所含化学成分的特征和生物合成的途径；探索化学成分在植物系统中的分布规律；根据植物中化合物的特征，进一步研究植物的系统发育。本实验将以堇菜属的两个物种为例，着重介绍植物化学分类学研究的基本方法一纸层析法和分类学分析方法。实验目的1.学习纸层析法的基本原理及操作方法。2.选择差异明显的实验材料，对其次生代谢产物（如黄酮类）进行层析，并对其结果进行分类学分析。实验材料与用品1.材料三色堇（ViolatricolorL.）、早开堇菜（ViolaprionanthaBunge）2.用品层析缸或大标本缸15个；毛细管若干；喷雾器；培养皿；层析滤纸；紫外分析灯：扩展剂：显色剂：预试浸提液：烘箱。实验内容与方法1.实验原理纸层析法是利用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。滤纸是较理想的支持介质，在纸上，水被吸附在纤维素的纤维间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，使这部分水不易扩散，因此与溶剂构成两相：固定相（水相）和流动相（有机相）。当有机流动相沿纸流动时，层析点上溶质就在水相和有机相间进行分配。随着有机相不断流动，溶质沿着有机相流动的方向移动，且不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因此可以彼此分开。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置通常用R值来表示，Rs=原点到层析点中心的距离／原点到溶剂前沿的距离（见图19.1)。一定条件下，某种物质的R，值是常数。R，值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。2.预准备2.1试剂固定相：新华1号滤纸

18 植物化学分类学中层析法的应用 植物化学分类学（Chemotaxonomy）诞生于 20 世纪 60 年代，是一门新兴的 边缘学科，该学科以化学为手段，以分类学为研究的最终目的。植物化学分类 学不仅在分子水平上提供分类学特征，而且还研究物种的系统发育在分子水平 上所反映的规律性。该学科的主要任务为：探索各分类阶元所含化学成分的特 征和生物合成的途径；探索化学成分在植物系统中的分布规律；根据植物中化 合物的特征，进一步研究植物的系统发育。 本实验将以堇菜属的两个物种为例，着重介绍植物化学分类学研究的基本方 法——纸层析法和分类学分析方法。 实验目的 1.学习纸层析法的基本原理及操作方法。 2.选择差异明显的实验材料，对其次生代谢产物（如黄酮类）进行层析，并对其结果进 行分类学分析。 实验材料与用品 1. 材料 三色堇（Viola tricolor L.）、早开堇菜（Viola prionantha Bunge） 2. 用品 层析缸或大标本缸 15 个；毛细管若干；喷雾器；培养皿；层析滤纸；紫外分析灯；扩 展剂；显色剂；预试浸提液；烘箱。 实验内容与方法 1. 实验原理 纸层析法是利用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。滤纸是较理想的支持介质，在纸上， 水被吸附在纤维素的纤维间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，使这部分水不易 扩散，因此与溶剂构成两相：固定相（水相）和流动相（有机相）。当有机流动相沿纸流动 时，层析点上溶质就在水相和有机相间进行分配。随着有机相不断流动，溶质沿着有机相流 动的方向移动，且不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因此可以彼 此分开。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置通常用 Rf 值来表 示，Rf = 原点到层析点中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离（见图 19.1）。一定条件下，某 种物质的 Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层 析温度等因素有关。 2. 预准备 2.1 试剂 固定相：新华 1 号滤纸

流动相：乙酰丙酮：95%乙醇：水=2：2：3显色剂：2%AICl3乙醇液，用于紫外灯下观察斑点位置和颜色2.2供试液制备的简单流程弃去残渣75%乙醇45ml回流提取2次叶粗粉（0.2g）合并乙醇液用石油醚萃取2次水浴蒸去乙醇，加20ml水★水溶液过滤★石油醚层水浴蒸干加乙醇（95%）★水层★残余物★供试液40ml溶解过滤溶剂前沿层析斑点YX点样原点图19.1层析中R值（=X/Y）的意义层析纸

流动相：乙酰丙酮：95%乙醇：水=2﹕2﹕3 显色剂：2%AlCl3 乙醇液，用于紫外灯下观察斑点位置和颜色 2.2 供试液制备的简单流程 图 19.1 层析中 Rf值（=X / Y）的意义 层析纸 75%乙醇 45ml 回流提取 2 次 弃去残渣 叶粗粉（0.2g） 合并乙醇液 水浴蒸去乙醇，加 20ml 水 用石油醚萃取 2 次 水溶液 过滤 石油醚层 水浴蒸干 加乙醇（95%） 水层 残余物 供试液 40ml 溶解过滤 X Y 层析斑点 溶剂前沿 点样原点

层析纸平衡液二将滤纸卷成筒状图19.2层析装置示意图3.实验步骤与方法3.1物种归属及特征三色董和早开董菜均为堇菜属（ViolaL.）植物，但属于不同的亚属和组。前者为美丽堇菜亚属（Subgen.Melanium）的三色堇菜组（Sect.Noverculae），后者为董菜亚属（SubgenViola）的合生托叶组（Sect.Adnatae）。目前，一般认为美丽堇菜亚属较原始，而堇菜亚属较进化。美丽堇菜亚属植物的柱头呈球状，近基部两侧有柔毛；柱头孔下方具瓣片状突起物；托叶大，羽状或掌状分裂。董菜亚属植物的柱头不呈头状，前方具喙，喙端具柱头孔。两者的形态区别见实验五，本实验将从其叶片所含的黄酮类物质方面探讨两者的区别。3.2实验步骤与方法将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中（见图19.2）。取长22cm，宽14cm的层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2-3cm处用铅笔划一条直线。在此直线上每间隔2cm作1记号。点样：用毛细管将供试液分别点在各记号位置处，千后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。扩展：用线将滤纸缝成筒状，但纸的两缘不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养血迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（见图19.2）。点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm。待溶剂上升15-20cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机吹干。显色：用喷雾器均匀喷洒2%AICl3乙醇液，后置100℃烘箱中烘烤5分钟，或用热风吹干，置紫外灯下观察斑点位置和颜色，并用铅笔圈出斑点。计算R值并比较分析。仔细对比和观察三色堇和早开堇菜两个物种的层析图谱，找出它们的共同点和不同点

图 19.2 层析装置示意图 3. 实验步骤与方法 3.1 物种归属及特征 三色堇和早开堇菜均为堇菜属（Viola L.）植物，但属于不同的亚属和组。前者为美丽 堇菜亚属（Subgen. Melanium）的三色堇菜组（Sect. Noverculae），后者为堇菜亚属（Subgen. Viola）的合生托叶组（Sect. Adnatae）。目前，一般认为美丽堇菜亚属较原始，而堇菜亚属 较进化。 美丽堇菜亚属植物的柱头呈球状，近基部两侧有柔毛；柱头孔下方具瓣片状突起物；托 叶大，羽状或掌状分裂。堇菜亚属植物的柱头不呈头状，前方具喙，喙端具柱头孔。 两者的形态区别见实验五，本实验将从其叶片所含的黄酮类物质方面探讨两者的区别。 3.2 实验步骤与方法 ) 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中（见图 19.2）。 取长 22cm，宽 14cm 的层析滤纸一张。在纸的一端距边缘 2-3cm 处用铅笔划一条直线。 在此直线上每间隔 2cm 作 1 记号。 点样：用毛细管将供试液分别点在各记号位置处，干后再点一次。每点在纸上扩散的直 径最大不超过 3mm。 扩展：用线将滤纸缝成筒状，但纸的两缘不能接触。将盛有约 20ml 扩展剂的培养皿迅 速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（见图 19.2）。点样的一端在下，扩展剂 的液面需低于点样线 1cm。待溶剂上升 15-20cm 时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线， 自然干燥或用吹风机吹干。 显色：用喷雾器均匀喷洒 2%AlCl3乙醇液，后置 100℃烘箱中烘烤 5 分钟，或用热风吹 干，置紫外灯下观察斑点位置和颜色，并用铅笔圈出斑点。 计算 Rf值并比较分析。 仔细对比和观察三色堇和早开堇菜两个物种的层析图谱，找出它们的共同点和不同点。 将滤纸卷成筒状 层析纸 平衡液

00000000000ood0000000006原点BcDEFGHA图19.3同一属中8个物种层析图其余B-I为8个物种）（其中A为标准液

图 19.3 同一属中 8 个物种层析图（其中 A 为标准液，其余 B-I 为 8 个物种） 原点 A B C D E F G H I

实验报告姓名：专业：班级：组号：成绩：实验名称：1.根据以上的实验结果，分析三色堇和早开董菜在黄酮类物质组成上的异同。2.将观察和分析后的层析滤纸贴于下面

实验报告 姓名: 专业: 班级: 组号： 成绩： 实验名称: 1．根据以上的实验结果，分析三色堇和早开堇菜在黄酮类物质组成上的异同。 2．将观察和分析后的层析滤纸贴于下面