浙江大学：《单细胞组学》课程教学课件（讲稿）单细胞分离分选；单细胞悬制备、扩增和测序技术（2/2）

单细胞分离分选；单细胞悬制备、扩增和测序技术(2)

单细胞分离分选； 单细胞悬制备、扩增和测序技术（2）

基因测序技术的发展CostperHumanGenome$100,000,000$10,000,000Moore'sLaw$1,000.000$100.000$10.000lational HumanGenomeNIHsearohInstitute$1,000genome.gov/sequencingcosts$1002001200220032004200520062007:2008:2009201020112012201320142015201620172018201920202021

基因测序技术一代测序（代表：sanger测序）第一代测序由英国的生化学家，弗雷德里克·桑格（FrederickSanger）发明，在桑格法测序中，由双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）造成的DNA聚合反应终止现象是实现测序的核心，因此也被成为双脱氧终止法测序二代测序（代表：illumina、华大）下一代测序技术（Next-generationsequencingtechnology），又称高通量测序技术（Highthroughputsequencing），可以一次性并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。三代测序（代表：PacBio、OxfordNanopore）Nanopore最长的读长可达3万个碱基，是目前最长的测序技术，同时可以测到DNA上的甲基化修饰，测序的速度也很快

一代测序（代表：sanger测序） 第一代测序由英国的生化学家，弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）发明，在桑格法测序中，由双脱氧 核苷三磷酸（ddNTP）造成的DNA聚合反应终止现象是实现测序的核心，因此也被成为双脱氧终止法测序。 二代测序（代表：illumina、华大） 下一代测序技术（Next –generation sequencing technology），又称高通量测序技术（High￾throughput sequencing），可以一次性并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。 三代测序（代表：PacBio、Oxford Nanopore ） Nanopore最长的读长可达3万个碱基，是目前最长的测序技术，同时可以测到DNA上的甲基化修饰，测序 的速度也很快

一代基因测序技术（Sanger）基于第一代测序技术的测序仪几乎都是采用Sanger提出的链终止法。链终止法测序的核心原理是ddNTP的2和3端都不含羟基，因此在合成核酸链的过程中无法形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断，Firstgenerationsequencing(Sanger)1GenomicDNA↓山山2FragmentedDNA3CloningandamplificationO03'...GACTGGA4 Sequencing5CTGATCTGATCTGATGAT5DetectionCTGATCTACTGATCTAGGCTCGCACT.CTGATCTAGGCTCGCACT

基于第一代测序技术的测序仪几乎都是采用Sanger提出的链终止法。链终止法测序的核心原理是ddNTP的2' 和3'端都不含羟基，因此在合成核酸链的过程中无法形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断

二代基因测序技术（lllumina）Illumina测序技术的原理是将DNA分子随机地固定在一块玻璃芯片上然后通过PCR扩增，使其形成一个小的DNA簇。接着，通过荧光标记的核苷酸逐个加入到DNA链上，每次加入一个核苷酸后，就会发出一个荧光信号，这个信号会被检测器检测到并记录下来。FragmentsAddadaptorsAttachtoflowcellnPCR extensionBind to primerDissociation州Cluster formationNovaSeq60o0SequencingSignal scanning

NovaSeq 6000 Illumina测序技术的原理是将DNA分子随机地固定在一块玻璃芯片上,然后通过PCR扩增,使其形成一个小的DNA 簇。接着,通过荧光标记的核苷酸逐个加入到DNA链上,每次加入一个核苷酸后,就会发出一个荧光信号,这个信号会 被检测器检测到并记录下来

二代基因测序技术（华大-CompleteGenomics）华大DNBSEQ测序平台采用的是DNB（DNANanoball，DNA纳米球核心测序技术，独特的线性扩增模式。完成模版扩增后，DNB将转载到PatternedArray（规则阵列）上进行测序DNA纳米球测序技术一线性扩增无错误累积99Q:高准确性低标签跳跃率低重复序列率纳米阵州恒点设计游字特度高且不产生售号干扰线性扩广增模式华大智造DNBSEQ-T7测序仪无PCR累计排读

华大DNBSEQ测序平台采用的是DNB（DNA Nanoball ，DNA纳米球核心测序技术，独特的线性扩增 模式。完成模版扩增后，DNB将转载到Patterned Array（规则阵列）上进行测序。 华大智造DNBSEQ-T7测序仪

国产华大测序技术的崛起声明作者：华大智造时间：2022-05-07我们很高兴看到，美国特拉华州地区法院的陪审团判决支持了我们的全部请求，包1.因美纳（Ilumina）故意对华大智造（MGI）的双色测序技术（Two-colorsequencingtechnology）"专利侵权。2.因美纳（Illumina）反诉中提到的专利全部被判无效。3.华大智造（MGI）获得3.34亿美元赔偿。保护知识产权对全球生命科技企业都非常重要，也是华大智造一直所坚持的价值观。我们愿和同道一起，致力于通过技术创新来推动行业发展，给世界更多选择的权利。我们将继续坚持开放包容，践行基因科技造福人类。华大智造2022年5月7日

三代基因测序技术（Oxfordnanopore）纳米孔测序在MiniON的核心部分，一种酶解开DNA双链，将其中一条链福穿过蛋白孔。每个DNA碱基的独特形状能够造成特有的电流干扰，从而读出序列。DNA双螺旋DNA碱基解旋酶蛋白孔细胞膜电流离子电流序列

单细菌测序技术面临的挑战》细菌的尺寸小，分离成单菌困难>细菌聚集和较低细菌量>复杂的细菌细胞壁》单细菌mRNA含量较低且缺少ployA尾巴，rRNA含量多》单细菌基因组DNA扩增难度大Raes et al., Cell, 2022

Ø 细菌的尺寸小，分离成单菌困难 Ø 细菌聚集和较低细菌量 Ø 复杂的细菌细胞壁 Ø 单细菌mRNA含量较低且缺少ploy A尾巴，rRNA含量多 Ø 单细菌基因组DNA扩增难度大 Raes et al., Cell, 2022 单细菌测序技术面临的挑战

单细菌基因组测序技术SiC-seqbaGeneratebdropletsDNAC》将单个细胞封装在熔融的琼脂糖微滴中，聚合后提供半渗透基质固定细菌细胞，在微流体设备中处理这些微凝胶，以生成用于测序的单细胞基因组文库Abateetal..Nat.Biotechnol..2017

Abate et al., Nat. Biotechnol. ,2017 单细菌基因组测序技术——SiC-seq Ø 将单个细胞封装在熔融的琼脂糖微 滴中，聚合后提供半渗透基质固定 细菌细胞，在微流体设备中处理这 些微凝胶，以生成用于测序的单细 胞基因组文库