山东第一医科大学（泰山医学院）：《分子生物学》课程教学课件（打印版）第五章 分子生物学技术（研究方法）

第五章分子生物学研究方法 本章主要内容： 1、重组DNA技术发展史上的重大事件 2、常见DNA操作技术 3、基因克隆技术 4、基因表达研究技术 5、基因芯片及数据分析 6、蛋白质组学及其研究技术

Contents 1、重组DNA技术发展史上的重大事件 2、常见DNA操作技术 3、基因克隆技术 4、基因表达研究技术 5、基因芯片及数据分析 6、蛋白质组学及其研究技术

二、重组DNA的主要内容或步骤： 分离出带有目基因的DNA片段 o x 与载体连接形成重组DNA分子 的 转移到受体细胞（寄主细胞） 3 韩选出获得了重组DNA分子的 受体细胞 将目的基因克隆到表达载体 上，导入寄主细胞产生出人类 所需要的物质 县物赞黑春读 转基因动物转基因植物

表5-2重组DNA实验中常见的主要工具酶 酶类 功能 限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶 通过磷酸二酯健把两个或多个DNA片新连接成一个 DNA分子 DNA聚合酶I(大肠杆菌) 按5？到3'方向加入新的核#酸，补平DNA双链中的缺 反转录酶 按照RNA分子中的减基序列，根据减基互补原则合成 DNA链 多核苷酸酶 把磷酸集田加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末 端标记实验或用来进行DNA的连接) 末端转移酶 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶Ⅲ 从DNA链的3'末端逐个切除单核#酸 入噬菌体DNA外切酶 从DNA链的5？末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸集田

三、基因克隆的主要载体象统 载体：载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工 具，基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒 (plasmid)、噬菌体(phage))和病毒(irus)三大类。这 些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一 些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等

质粒(plasmid) Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 Plasmid chromosome 00000

171 ·基图载体应具备的条件： a ·(1)有多种限制性内切酶切点，但每种切口最 好只有1个； (2)有选择标记，倒如抗药性标记，蓝白斑试 验； ·(3)有一定容量； ”(4)有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳 的最多数

多克隆位点 0 polylinker 复制起始点 ori Amp 遗传标记 基因栽体

·蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖 苷酶)该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-BD-半乳糖苷)产生蓝色，从而 使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基 因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重 组细菌。称之为蓝~白斑筛选

小结 ·1、在20世纪分子生物学取得的3大成就 ·2、重组DNA的主要内容或步骤 ·3、基因克隆的主要载体条统