安徽医科大学：《医学形态学》课程教学资源（PPT课件）基础性综合实验4 病毒的分离培养鉴定和血清学检测

病毒的分离培养鉴定和血清 学检测

病毒的分离培养鉴定和血清 学检测

病毒的鸡胚接种法 病毒需严格细胞内寄生，培养病毒必须在 活的动物、鸡胚或细胞内进行。新城疫病 毒(NDV)、流感病毒(IFV) 等对鸡胚培 养敏感，因此常用鸡胚接种法分离培养 NDV、IFV等。目前对FV的疫苗制备就是 在鸡胚培养中进行的。由于NDV、IFV在鸡 胚内培养时并不引起明显的鸡胚病变或死 亡，常用血凝和血凝抑制试验对病毒进行 鉴定

病毒需严格细胞内寄生，培养病毒必须在 活的动物、鸡胚或细胞内进行。新城疫病 毒（NDV）、流感病毒（IFV）等对鸡胚培 养敏感，因此常用鸡胚接种法分离培养 NDV、IFV等。目前对IFV的疫苗制备就是 在鸡胚培养中进行的。由于NDV、IFV在鸡 胚内培养时并不引起明显的鸡胚病变或死 亡，常用血凝和血凝抑制试验对病毒进行 鉴定。 一 病毒的鸡胚接种法

(一)接种方法 1)孵育9~11天左右的鸡胚，在照蛋灯下用 蜡笔标出气室和胎位； 2)鸡胚直立于蛋盘上， 气室端向上，按常规 以碘酒，酒精消毒； 3)在避开鸡头和大血管的位置，用磨蛋器在 气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭消毒；

（一）接种方法 1）孵育9~11天左右的鸡胚，在照蛋灯下用 蜡笔标出气室和胎位； 2）鸡胚直立于蛋盘上，气室端向上，按常规 以碘酒，酒精消毒； 3）在避开鸡头和大血管的位置，用磨蛋器在 气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭消毒；

4)用1ml注射器吸取NDV悬液，针头从气室 小孔刺入（沿胚胎的长轴刺入）0.5-1cm 深度；此时针头已在尿囊腔中，注入0.2ml 病毒悬液 5) 拔出针头，用镊子将小胶布蘸取酒精烧灼 后封闭小孔，置于35~36℃温箱内培养，其 中翻动两次，用照蛋灯检视一次，36小时 后置-20℃冰箱20分钟后，无菌操作收获尿 囊液

4）用1ml注射器吸取NDV悬液，针头从气室 小孔刺入（沿胚胎的长轴刺入）0.5--1cm 深度；此时针头已在尿囊腔中，注入0.2ml 病毒悬液； 5）拔出针头，用镊子将小胶布蘸取酒精烧灼 后封闭小孔，置于35~36℃温箱内培养，其 中翻动两次，用照蛋灯检视一次，36小时 后置-20℃冰箱20分钟后，无菌操作收获尿 囊液

鸡胚的检卵 v7h

鸡胚的检卵

(二)尿囊液的收获 1)从冰箱中取出鸡胚，用碘酒、酒精消毒气 室部位； 2)用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵 壳； 3)用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取 尿囊液（避免血管破裂），置于无菌中号试管 中； 4)获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制 试验（定性），判断病毒的增殖情况并对 病毒进行鉴定；同时做无菌实验

1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒、酒精消毒气 室部位； 2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵 壳； 3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取 尿囊液(避免血管破裂)，置于无菌中号试管 中； 4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制 试验（定性），判断病毒的增殖情况并对 病毒进行鉴定；同时做无菌实验。 （二） 尿囊液的收获

(三)血凝和血凝抑制实验 某些病毒包膜表面的血凝素(HA)能与人 “O”型红细胞、脊椎动物如豚鼠、鸡等的 红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞 凝集。在病毒悬液中加入相应的特异性抗 血清后，由于相应的抗体与HA结合，使其 失去凝集作用，再加入人的“O”型血、鸡 或豚鼠的红细胞则不再发生血凝现象，即 为血凝抑制。上述两种现象可作为判断病 毒存在的指标及鉴定病毒

某些病毒包膜表面的血凝素（HA）能与人 “O”型红细胞、脊椎动物如豚鼠、鸡等的 红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞 凝集。在病毒悬液中加入相应的特异性抗 血清后，由于相应的抗体与HA结合，使其 失去凝集作用，再加入人的“O”型血、鸡 或豚鼠的红细胞则不再发生血凝现象，即 为血凝抑制。上述两种现象可作为判断病 毒存在的指标及鉴定病毒。 （三） 血凝和血凝抑制实验

1.血凝实验： ①取U型孔有机玻璃板一块，按顺序编号； ②于第1孔加入生理盐水0.9ml,余孔各加0.5ml; ③于第1孔加收获的尿囊液0.1ml; ④另取一支吸管将第1孔混匀后吸取0.5ml至第2孔； 再将第2孔混匀后吸0.5ml至第3孔，以次类推， 直至第8孔，从第8孔中吸取0.5ml弃去。第9孔 不含病毒，为红细胞对照孔。每孔加入1%鸡血 球0.25ml

1.血凝实验： ①取U型孔有机玻璃板一块，按顺序编号； ②于第1孔加入生理盐水0.9ml，余孔各加0.5ml； ③于第1孔加收获的尿囊液0.1 ml； ④另取一支吸管将第1孔混匀后吸取0.5ml至第2孔； 再将第2孔混匀后吸0.5 ml 至第3孔，以次类推， 直至第8孔，从第8孔中吸取0.5 ml 弃去。第9孔 不含病毒，为红细胞对照孔。每孔加入1％鸡血 球0.25ml

孔号 123456789 生理盐 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 水(ml) 病毒液 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃 (ml) 病毒液 1: 1: 稀释度 10 20 40 80 160 320 640 1280 1%鸡红 细胞(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 生理盐 水(ml) 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 病毒液 (ml) 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃 0.5 病毒液 稀释度 1： 10 1： 20 1： 40 1： 80 1： 160 1： 320 1： 640 1： 1280 — 1%鸡红 细胞(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

立即摇匀，置室温30~45分钟后观察结果。 注：弃去的液体及吸管一起放入盐酸桶中消毒 [结果判断] “+”号多少表示血凝程度： “++++”100%的RBC发生血凝，形成花边拉 网状： “+++”75%的RBC发生血凝血凝效价 的判断： “++”50%的RBC发生血凝； “+” 25%的RBC发生血凝；“-”100%的RBC沉积。 血凝效价以出现“2十”为终点，即50%的 RBC发生血凝的最高稀释倍数为病毒的血凝效 价

立即摇匀，置室温30~45分钟后观察结果。 注：弃去的液体及吸管一起放入盐酸桶中消毒 [结果判断] “+”号多少表示血凝程度： “++++” 100％的RBC发生血凝，形成花边拉 网状； “+++” 75％的RBC发生血凝血凝效价 的判断； “++” 50％的RBC发生血凝； “+” 25％的RBC发生血凝；“-” 100％的RBC沉积。 血凝效价以出现“2＋”为终点，即50％的 RBC发生血凝的最高稀释倍数为病毒的血凝效 价