重庆医科大学：基础医学实验教学课件（PPT讲稿）质粒的提取与鉴定

质粒DNA的提取和鉴定

质粒DNA的提 取和鉴定

实验目的实验原理实验仪器和试剂一实验步骤四注意事项五思考题六

实验目的 实验原理 实验仪器和试剂 实验步骤 一 二 三 四 注意事项 思考题 五 六

一、实验自的心了解质粒的基本特性和其应用；心掌握碱裂解法提取质粒DNA的基本原理和实验方法

一、实验目的 ❖了解质粒的基本特性和其应用； ❖掌握碱裂解法提取质粒DNA的基本原理和实验方法

二、基本原理细菌细菌染色体A1.质粒DNAM轮心质粒是存在于细菌染色体之外的小型环状双链DNA分子：心质粒具有复制起始区，能独立自1umR主的复制，且在细菌中的拷贝数DNA少的有1～2个，多达10个以上；心质粒具有抗生素抗性基因等，可大肠杆菌细胞质粒赋予细菌相应的表型，抗菌素抗性基因控制质粒DNA转移的基因

二、基本原理 ❖质粒是存在于细菌染色体之外的 小型环状双链DNA分子； ❖质粒具有复制起始区，能独立自 主的复制，且在细菌中的拷贝数 少的有1～2个，多达10个以上； ❖质粒具有抗生素抗性基因等，可 赋予细菌相应的表型。 1. 质粒DNA

2.质粒DNA-pTA2-basic和pTA2-p53ori抗生素基因：AmpA多克隆位点：MCSlac复制起始点：oriAmpKpnl-EcoRIPTA2其它：lac操纵子和XMCS2981bpEcoRIlac基因SacllacpromoterpUCori

❖ 抗生素基因：Amp ❖ 多克隆位点：MCS ❖ 复制起始点：ori ❖ 其它：lac操纵子和 lac基因 2. 质粒DNA-pTA2-basic和pTA2-p53

oriBlacAmpKpnEcoRIpTA2-p53p53geneEcORI3956bpSacllacpromoterpUCoripTA-p53质粒为：：3956bp（p53为1179bp）

pTA-p53质粒为：3956bp（p53为1179bp）

3.质粒DNA的提取方法提取质粒：碱裂解法、煮沸法、氯化艳密度梯度离心法等纯化质粒DNA：酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附法磁珠吸附法等质量鉴定：琼脂糖电泳、OD值

3.质粒DNA的提取方法 ◆提取质粒：碱裂解法、煮沸法、氯化铯密度梯 度离心法等 ◆纯化质粒DNA：酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附法 、 磁珠吸附法等 ◆质量鉴定：琼脂糖电泳、OD值

质粒DNA的提取方法碱裂解法原理：pH中性PH值介于12.0~12.5闭合环状的质粒DNA氢键会被断裂质粒DNA的两条互补链仍保持在一但两条互补链彼此相互盘绕.仍会紧起，因此复性迅速而准确。密地结合在一起。线性的DNA（染色体DNA）双螺旋线性的染色体DNA两条互补链彼此结构解开而被变性已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去

质粒DNA的提取方法 碱裂解法原理： pH值介于12.0~12.5 pH中性 闭合环状的质粒DNA氢键会被断裂, 但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧 密地结合在一起。 质粒DNA的两条互补链仍保持在一 起，因此复性迅速而准确。 线性的DNA（染色体DNA）双螺旋 结构解开而被变性 线性的染色体DNA两条互补链彼此 已完全分开，复性就不会那么迅速 而准确，它们缠绕形成网状结构。 通过离心，染色体DNA与不稳定的 大分子RNA、蛋白质-SDS复合物 等一起沉淀下来而被除去

三、实验仪器和试剂心仪器：★培养细菌所需：恒温摇床、超净台、锥形瓶、细菌培养血等★提取质粒所需：高速离心机、离心管、移液器、吸头★质粒定量所需：紫外分光光度计心试剂：★培养细菌：LB固体培养基、LB液体培养基、抗生素★提取质粒：TAKARA公司试剂盒

三、实验仪器和试剂 ❖仪器： ★培养细菌所需：恒温摇床、超净台、锥形瓶、细菌培 养皿等 ★提取质粒所需：高速离心机、离心管、移液器、吸头 ★质粒定量所需：紫外分光光度计 ❖试剂： ★培养细菌：LB固体培养基、LB液体培养基、抗生素 ★提取质粒：TAKARA公司试剂盒

四、实验步骤>挑单克隆菌株接种液体培养液内（含抗生素）；>37℃C振荡过夜培养；>离心后收集菌液，提取质粒

➢挑单克隆菌株接种液体培养液内(含抗生素)； ➢37℃振荡过夜培养； ➢ 离心后收集菌液，提取质粒 四、实验步骤