《临床检验仪器学》课程教学资源（文献资料）第17章 PCR基因扩增仪知识扩充

PCR基因扩增仪知识扩完 首页一第十七章PCR基因扩增仪 实时荧光定量PCR进展及其应用 荧光实时定量PCR技术最早在1992年由一位日本人Hi guchi第一次报告提出，他当时 想实时看到P©R反应的整个过程，由于当时B(溴化乙锭)的广泛使用，最直接想到的标 记染料就是B,可以插入到双链核酸中受激发光，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到 双链核酸中B的含量就能实时监控PCR反应的进程，考虑到PCR反应的数学函数关系，结 合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。这 样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台实时定量PCR仪就诞生了。 而真正市场化的是美国应用生物系统公司1996年推出的荧光定量PCR仪。 一，实时荧光定量PCR技术的方法学 原理： 在real-timeQ-PCR中，对整个PR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增 相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在 PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性 期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且 由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-tieQ-PCR反应的 指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline),英光域值的缺省设置是3~15个循环 的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可 用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域 值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性 关系，起始拷贝数越多，C1值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此 只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 荧光化学：

首页 → 第十七章 PCR 基因扩增仪 实时荧光定量 PCR 进展及其应用 荧光实时定量 PCR 技术最早在 1992 年由一位日本人 Higuchi 第一次报告提出，他当时 想实时看到 PCR 反应的整个过程，由于当时 EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标 记染料就是 EB，可以插入到双链核酸中受激发光，在 PCR 反应的退火或延伸时检测掺入到 双链核酸中 EB 的含量就能实时监控 PCR 反应的进程，考虑到 PCR 反应的数学函数关系，结 合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。这 样，在普通 PCR 仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台实时定量 PCR 仪就诞生了。 而真正市场化的是美国应用生物系统公司 1996 年推出的荧光定量 PCR 仪。 一. 实时荧光定量 PCR 技术的方法学 原理： 在 real-time Q-PCR 中，对整个 PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增 相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在 PCR 反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性 期和最终的平台期，因此可以在 PCR 反应处于指数期的某一点上来检测 PCR 产物的量，并且 由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在 real-time Q-PCR 反应的 指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是 3～15 个循环 的荧光信号的标准偏差的 10 倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可 用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域 值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性 关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此 只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 荧光化学：

目前real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：D结合染色，水 解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测 两大类。 1.扩增序列非特异性检测方法 该方法的基础是DNM结合的荧光分子，如SYBR green1等荧光染料。Real-tieQ-PCR 发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR反应体系中，加入过量SYBR green1荧光染 料，SYBR green1荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在 于它能监测任何dsDA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低 了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDA (如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔 解曲线(melting curve)分析的软件加以解决 2。扩增序列特异性检测方法 在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接 法和间接法。 间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-tieQ-PCR中最广泛使用的TaqMan 系统就是运用了这个原理。PC扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针， 该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5'端荧 光基团吸收能量后将能量转移给临近的3'端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移 RET),因此探针完整时，检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中， 溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向 前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5'-3'外切酶活性（此活性是双链特异性 的，游离的单链探针不受影响)将探针5'端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反 应体系中，从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标 (molecular beacon)就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子星 发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。 当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团 与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生 可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系 统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PC引物相结合，从而使荧光标记基团直接 掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种：日出引物(sunrise primes)和蝎子引物(scorpion primes)。杂交探针(hybridization probe)使用两个特异的探针，其中上游的探针的3 端标记有供体荧光素(donor),而下游的探针的5'端标记有受体荧光素(acceptor)。在

目前 real-time Q-PCR 所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA 结合染色，水 解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测 两大类。 1. 扩增序列非特异性检测方法 该方法的基础是 DNA 结合的荧光分子，如 SYBR green 1 等荧光染料。Real-time Q-PCR 发展早期就是运用这种最简单的方法，在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR green 1 荧光染 料，SYBR green 1 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在 于它能监测任何 dsDNA 序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低 了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何 dsDNA 结合，因此它也能与非特异的 dsDNA （如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔 解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。 2. 扩增序列特异性检测方法 在 PCR 反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接 法和间接法。 间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在 real-time Q-PCR 中最广泛使用的 TaqMan 系统就是运用了这个原理。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针， 该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时 5′端荧 光基团吸收能量后将能量转移给临近的 3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移， FRET），因此探针完整时，检测不到该探针 5′端荧光基团发出的荧光。但在 PCR 扩增中， 溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向 前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq 酶的 5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性 的，游离的单链探针不受影响）将探针 5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反 应体系中，从而脱离 3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。 直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标 （molecular beacon）就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈 发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。 当互补序列出现时，探针与 DNA 杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团 与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生 可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系 统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与 PCR 引物相结合，从而使荧光标记基团直接 掺入 PCR 扩增产物中。目前主要有两种：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。杂交探针（hybridization probe）使用两个特异的探针，其中上游的探针的 3′ 端标记有供体荧光素（donor），而下游的探针的 5′端标记有受体荧光素（acceptor）。在

PCR中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体 荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移(FET,此作用与上述水解探针的方式相 反)，使得受体荧光基团发出荧光：当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运 用了两个探针，因此增了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线(melting cuv©)对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息，杂交探针非常适合 SNPs的研究分析。 定量方法： 在real-timeQ-PCR中，模板定量有两种策略：相对定量和绝对定量。相对定量指的是 在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来 推算未知的样本的量。 1.标准曲线法的相对定量 由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线新 比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列 的量米自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参 照物量的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的W或DNM的量，往往在反应中同时扩 增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如beta-actin,3 磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等)。 2.比较CT法的相对定量 比较CT法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对 量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始 模板的量，一个循环(CT=1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因 和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。 3.标准曲线法的绝对定量 此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。质粒DNA 和体外转入的NA常作为绝对定量标准品的制各之用。标准品的量可根据260m的吸光度位 并用DNM或RNM的分子量来转换成其拷贝数来确定。 二·存在的问题及应用前景 在real-timeQ-PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些问题有 待解决。在标淮曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准 各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用 real-tieQ-PCR来研究RNM时，受到不同RN样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制

PCR 中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体 荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移（FRET，此作用与上述水解探针的方式相 反），使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运 用了两个探针，因此增了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线（melting curve）对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息，杂交探针非常适合 SNPs 的研究分析。 定量方法： 在 real-time Q-PCR 中，模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是 在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来 推算未知的样本的量。 1. 标准曲线法的相对定量 由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就 比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列 的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是 1*的样本，其它的样本为参 照物量的 n 倍。在实验中为了标准化加入反应体系的 RNA 或 DNA 的量，往往在反应中同时扩 增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如 beta-actin,3- 磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 等）。 2. 比较 CT 法的相对定量 比较 CT 法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对 量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在 PCR 反应的指数期得到 CT 值来反应起始 模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数 2 倍的差异。但是此方法是以靶基因 和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。 3. 标准曲线法的绝对定量 此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。质粒 DNA 和体外转入的 RNA 常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据 260nm 的吸光度值 并用 DNA 或 RNA 的分子量来转换成其拷贝数来确定。 二. 存在的问题及应用前景 在 real-time Q-PCR 技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些问题有 待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准， 各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用 real-time Q-PCR 来研究 mRNA 时，受到不同 RNA 样本存在不同的逆转录（RT）效率的限制

在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实 验条件影响的内源控制物也是实验结果可与否的关键。另外，与传统的PCR技术相比， Real-timeQ-PCR的不足之处是：(I)因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地 限制了real-timeQ-PCR的复合式(oultiplex)检测的应用能力：(2)real-time Q-PCR 实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展。目前ral-ti Q-PCR己已成为科研的主要工具，该技术未来的应用前绿是令人鼓舞的，一方面real-timc QPC技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。 另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及real-timeQ-PCR技术 的应用，使定量PCR技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于临床医 生对疾病的诊断和治疗

在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实 验条件影响的内源控制物也是实验结果可与否的关键。另外，与传统的 PCR 技术相比， Real-time Q-PCR 的不足之处是：（1）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地 限制了 real-time Q-PCR 的复合式（multiplex）检测的应用能力；（2）real-time Q-PCR 实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展。目前 real-time Q-PCR 已成为科研的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的，一方面 real-time Q-PCR 技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或 DNA 拷贝数成为可能。 另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及real-time Q-PCR技术 的应用，使定量 PCR 技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于临床医 生对疾病的诊断和治疗