《临床检验仪器学》课程教学资源（实验指导）实验16 酶标仪性能评价指标测试

实验16酶标仪性能评价指标测试 实验目的 1.了解酶标仪的原理和结构。 2.掌握酶标仪的性能评价指标和测试方法。 实验器材 酶标仪一台，高精度紫外可见分光光度计一台，96孔板若干，6g/ml重铬 酸钾溶液，0.05mol/L硫酸溶液，1mmol/L对硝基苯酚水溶液，10mmol/LNa0H 溶液，甲基橙溶液，蒸馏水。 实验原理 酶标仪即是一台变相的光电比色计或分光光度计，按比色法的原理来分离抗 原或抗体的含量。它与普通光电比色计的不同之处在于：比色用的容器不是比色 皿，而是用的塑料微孔板：酶标仪以垂直光束通过微孔板中的待测液，而不是水 平通过待测液：酶标仪通常使用光密度O心来表示吸光度。其基本结构和工作原 理如图16-1所示。 显示器 打印机 样品室部 X方向驱动装置Y方向驱动装置 图16-1酶标仪工作原理图 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,.ELISA)是固相酶免疫 测定的技术之一。其基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体（多用聚苯 乙烯微孔板)表面，再用酶标记的抗体或抗原与已固定的相应抗原或抗体发生特 异性反应，加入酶底物及色原后显色，用酶标仪测定反应液的吸光度值(A), 所测A值与待测抗原或抗体呈相关关系。不同厂家生产的微孔板式ELISA试剂

实验 16 酶标仪性能评价指标测试 实验目的 1.了解酶标仪的原理和结构。 2.掌握酶标仪的性能评价指标和测试方法。 实验器材 酶标仪一台，高精度紫外可见分光光度计一台，96 孔板若干，6µg/ml 重铬 酸钾溶液，0.05 mo1/L 硫酸溶液，1mmol/L 对硝基苯酚水溶液，10mmo1/L NaOH 溶液，甲基橙溶液，蒸馏水。 实验原理 酶标仪即是一台变相的光电比色计或分光光度计，按比色法的原理来分离抗 原或抗体的含量。它与普通光电比色计的不同之处在于：比色用的容器不是比色 皿，而是用的塑料微孔板；酶标仪以垂直光束通过微孔板中的待测液,而不是水 平通过待测液；酶标仪通常使用光密度 OD 来表示吸光度。其基本结构和工作原 理如图 16-1 所示。 图 16-1 酶标仪工作原理图 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是固相酶免疫 测定的技术之一。其基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体（多用聚苯 乙烯微孔板）表面，再用酶标记的抗体或抗原与已固定的相应抗原或抗体发生特 异性反应，加入酶底物及色原后显色，用酶标仪测定反应液的吸光度值（A）， 所测 A 值与待测抗原或抗体呈相关关系。不同厂家生产的微孔板式 ELISA 试剂 光 源 灯 滤 光 片 样品室部件 微 孔 板 光 电 检 测 器 键 盘 打印机 X 方向驱动装置 Y 方向驱动装置 控 制 电 路 模 拟 信 号 处 理 微 机 单 元 显示器

种类繁多，但均采用规格统一的8×12的96孔微板。因此各仪器厂家生产的微孔 板式酶标仪均适用于不同厂家的试剂产品。 酶标仪的性能合格与否直接影响检验结果的准确性，因此各实验室的酶标仪 应定期进行一些性能指标的测试，以确保仪器保持良好的状态。酶标仪性能评价 指标包括滤光片波长精度检查及其峰值测定、灵敏度和准确度的监测、通道差与 孔间差检测、零点飘移、精密度评价、线性测定、双波长评价等。 实验步骤 1.滤光片波长精度检查及其峰值测定 酶标仪的滤光片质量好坏，直接影响仪器的灵敏度高低，而滤光片的质量又 是以其波长精度及其峰值指标来衡量的，因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标 仪的重要参数之一。 检测方法：用高精度紫外可见分光光度计（波长精度±0.3m)对不同波长 的滤光片进行光谱扫描，检测值与标定值之差即为滤光片波长精度，其差值越接 近于零且峰值越大表示滤光片的质量越好，波长精度越高。 2.灵敏度和准确度的检测 仪器的灵敏度和准确度主要受两个因素影响：一是滤光片波长的精度，二是 检测器的质量。 检测方法： ①灵敏度：精确配制6ug/ml重铬酸钾（干燥）溶液(0.05mol/L硫酸溶 解)，加入200重铬酸钾溶液于小孔杯中，以0.05mo1/L疏酸溶液作空白， 于450m(参比波长650nm)测定，其吸光度应≥0.01A。重复测定三次，观 察每次吸光度准确性与精密度。 ②准确度：准确配制1mmo/L对硝基苯酚（提纯品）水溶液，然后以10mmo1/几 氢氧化钠溶液稀释25倍，加入200ul稀释液于小孔杯中，以10 mmol/L Na0州 溶液作空白，于405nm(参比波长650nm)检测，其吸光度应在0.4A(0.395 0.408A)左右。重复测定三次，观察每次吸光度准确性与精密度。 3.通道差与孔间差检测 为了提高酶标仪的检测速度，根据96孔酶标板的规格特点，目前大多数厂 家的中、高档酶标仪采用了8通道的检测器（部分中、低档酶标仪仍采用单通道）， 每个通道的检测能力是不尽相同的，它是仪器内部的固有误差，与所测溶液浓度

种类繁多，但均采用规格统一的 8×12 的 96 孔微板。因此各仪器厂家生产的微孔 板式酶标仪均适用于不同厂家的试剂产品。 酶标仪的性能合格与否直接影响检验结果的准确性，因此各实验室的酶标仪 应定期进行一些性能指标的测试，以确保仪器保持良好的状态。酶标仪性能评价 指标包括滤光片波长精度检查及其峰值测定、灵敏度和准确度的监测、通道差与 孔间差检测、零点飘移、精密度评价、线性测定、双波长评价等。 实验步骤 1.滤光片波长精度检查及其峰值测定 酶标仪的滤光片质量好坏，直接影响仪器的灵敏度高低，而滤光片的质量又 是以其波长精度及其峰值指标来衡量的，因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标 仪的重要参数之一。 检测方法：用高精度紫外可见分光光度计（波长精度±0.3 nm）对不同波长 的滤光片进行光谱扫描，检测值与标定值之差即为滤光片波长精度，其差值越接 近于零且峰值越大表示滤光片的质量越好，波长精度越高。 2.灵敏度和准确度的检测 仪器的灵敏度和准确度主要受两个因素影响：一是滤光片波长的精度，二是 检测器的质量。 检测方法： ①灵敏度：精确配制 6 ug/ml 重铬酸钾（干燥）溶液（0.05 mo1/L 硫酸溶 解），加入 200 µl 重铬酸钾溶液于小孔杯中，以 0.05 mo1/L 硫酸溶液作空白， 于 450 nm（参比波长 650 nm）测定，其吸光度应≥ 0.01 A。重复测定三次，观 察每次吸光度准确性与精密度。 ②准确度：准确配制 1mmo/L 对硝基苯酚（提纯品）水溶液，然后以 10 mmo1/L 氢氧化钠溶液稀释 25 倍，加入 200µl 稀释液于小孔杯中，以 10 mmo1/L NaOH 溶液作空白，于 405 nm（参比波长 650 nm）检测，其吸光度应在 0.4 A（0.395～ 0.408 A）左右。重复测定三次，观察每次吸光度准确性与精密度。 3.通道差与孔间差检测 为了提高酶标仪的检测速度，根据 96 孔酶标板的规格特点，目前大多数厂 家的中、高档酶标仪采用了 8 通道的检测器（部分中、低档酶标仪仍采用单通道）， 每个通道的检测能力是不尽相同的，它是仪器内部的固有误差，与所测溶液浓度

成正相关（不同检测器对不同浓度溶液的响应能力不同），所以通道差是衡量酶 标仪性能良好与否的重要指标之一：其衡量指标用极差表示：极差值越接近于零， 通道差越小，说明同一样品于不同通道检测结果的一致性越好。如果是单通道酶 标仪则不需要进行这项检测。 由于不同厂家、不同批号酶标板之间的质量差异，导致孔与孔之间的检测结 果也不完全一致，因此存在孔间差。这是仪器外部的固有误差，只有准确测知孔 间差，并对结果作出相应的校正，才能使检验结果更符合实际情况、更准确可靠： 采用的评价指标（±1.96s)也是有利于结果校正的。 检测方法： ①通道差检测：取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑、透明、无划痕、无污染》 以酶标板架作载体，分别加入三种不同浓度的甲基橙溶液2001先后置于8个 通道的相应位置，蒸馏水调零，采用双波长（测定波长490m,参比波长630或 650加m,以下均相同)连续测三次，观察其不同通道之间测量结果的一致性可用 极差值来表示其通道差。 ②孔间差的测量：选择同一厂家、同一批号酶标板条(8条共96孔)分别 加入2001甲基橙溶液（吸光度调至0.065~0.070A)先后置于同一通道，蒸 馏水调零，采用双波长检测，其误差大小用±1.96s衡量。 4.零点飘移 通常情况下，酶标仪的零点飘移是很小的，这是由于仪器在读数之前，先要 做8个通道的本底测量(Io),然后再读取样品板的各孔测定值(I),根据Beer‘s 1aw光吸收值=1og10(Io/I),每次读数经过如此的自动校正，使得读数误差大 大降低：有的仪器采用"DRL DYE检测试条来进行绝对吸光度的校准，因此在采 用单波长测量时，会导致吸光度的假性增高，这种仪器可采取两种方法进行校正， 一是选择一合适的参比滤光片进行双波长测定，二是引入修正参数，即在吸光度 模式下单波长读取1个空白孔，其测试值和预测值之差值即为修正参数。所以零 点飘移是评价仪器在一定时间内零点吸光度的变化趋势，与波长无关，它间接地 反映了仪器内部检测系统在单位时间内处于工作状态下的稳定性及仪器的机械 性能情况（连续进板、检测、退出），故它是评估仪器内部电路系统、光学系统 (检测器)及机械系统良好与否的指标。 测试方法：取八只小孔杯，分别置于八个通道的相应位置，均加入200山

成正相关（不同检测器对不同浓度溶液的响应能力不同），所以通道差是衡量酶 标仪性能良好与否的重要指标之一；其衡量指标用极差表示；极差值越接近于零， 通道差越小，说明同一样品于不同通道检测结果的一致性越好。如果是单通道酶 标仪则不需要进行这项检测。 由于不同厂家、不同批号酶标板之间的质量差异，导致孔与孔之间的检测结 果也不完全一致，因此存在孔间差。这是仪器外部的固有误差，只有准确测知孔 间差，并对结果作出相应的校正，才能使检验结果更符合实际情况、更准确可靠； 采用的评价指标（±1.96s）也是有利于结果校正的。 检测方法： ①通道差检测：取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑、透明、无划痕、无污染） 以酶标板架作载体，分别加入三种不同浓度的甲基橙溶液 200 µl 先后置于 8 个 通道的相应位置，蒸馏水调零，采用双波长（测定波长 490nm，参比波长 630 或 650nm，以下均相同）连续测三次，观察其不同通道之间测量结果的一致性可用 极差值来表示其通道差。 ②孔间差的测量：选择同一厂家、同一批号酶标板条（8 条共 96 孔）分别 加入 200 µl 甲基橙溶液（吸光度调至 0.065～0.070 A）先后置于同一通道，蒸 馏水调零，采用双波长检测，其误差大小用±1.96s 衡量。 4.零点飘移 通常情况下，酶标仪的零点飘移是很小的，这是由于仪器在读数之前，先要 做 8 个通道的本底测量（Io），然后再读取样品板的各孔测定值（I），根据 Beer‘s law 光吸收值=1ogl0（Io／I），每次读数经过如此的自动校正，使得读数误差大 大降低；有的仪器采用"DRL DYE"检测试条来进行绝对吸光度的校准，因此在采 用单波长测量时，会导致吸光度的假性增高，这种仪器可采取两种方法进行校正， 一是选择一合适的参比滤光片进行双波长测定，二是引入修正参数，即在吸光度 模式下单波长读取 1 个空白孔，其测试值和预测值之差值即为修正参数。所以零 点飘移是评价仪器在一定时间内零点吸光度的变化趋势，与波长无关，它间接地 反映了仪器内部检测系统在单位时间内处于工作状态下的稳定性及仪器的机械 性能情况（连续进板、检测、退出），故它是评估仪器内部电路系统、光学系统 （检测器）及机械系统良好与否的指标。 测试方法：取八只小孔杯，分别置于八个通道的相应位置，均加入 200 µl

蒸馏水并调零，采用双波长或单波长(490nm)每隔30min测定一次，观察8 个通道4h内的吸光度变化。其与零点的差值即为零点飘移。 5.精密度评价 检测方法：每个通道三只小杯，分别加入2001高、中、低三种不同浓度 的甲基橙溶液，蒸馏水调零，采用双波长作双份平行测定，每日测定两次，连续 测定20天。分别计算其批内精密度、日内批间精密度、日间精密度和总精密度 及相应的CV值。 6.线性测定 测定方法：精确称取甲基橙配制5个系列浓度的溶液，采用双波长平行检测 8次求其均值。计算回归方程、相关系数r及标准估计误差Sy,x,并用±L.96Sy,x 表示样品的95%测量范围。 7.双波长评价 双波长测试过程中，由于标本中干扰组份的存在以及小孔杯本身质量等原 因，常常导致测定结果的假性增高，而酶标仪提供的双波长测定功能则可以消除 干扰组份或因素对测定结果的影响。在选择参比波长时，应对干扰组份的光谱进 行研究，以正确选择参比波长：而对于小孔杯本身质量问题等干扰因素的消除， 只要选择远离测定波长的参比波长即可以了。这对保证测定结果的准确性是非常 重要的。 评价方法：取同一厂、同一批号酶标板条（每个通道2条共24孔）每孔加 入200叫甲基橙溶液（吸光度调至0.065~0.070A)先后于8个通道分别采用单 波长(490nm)和双波长（测定波长490nm、参比波长630/650nm)进行检 测，计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度，比较各组之间是否具有统计 学差异以考察双波长清除干扰因素的效果。 数据记录及处理 表16-1湾光片被长精度检查（单位：m) 标尼值 拾测估 结论 表16-2灵数度和准确度的监测 灵敏度 准确度

蒸馏水并调零，采用双波长或单波长（490 nm）每隔 30 min 测定一次，观察 8 个通道 4h 内的吸光度变化。其与零点的差值即为零点飘移。 5.精密度评价 检测方法：每个通道三只小杯，分别加入 200 ul 高、中、低三种不同浓度 的甲基橙溶液，蒸馏水调零，采用双波长作双份平行测定，每日测定两次，连续 测定 20 天。分别计算其批内精密度、日内批间精密度、日间精密度和总精密度 及相应的 CV 值。 6.线性测定 测定方法：精确称取甲基橙配制 5 个系列浓度的溶液，采用双波长平行检测 8 次求其均值。计算回归方程、相关系数 r 及标准估计误差 Sy,x，并用±1.96 Sy,x 表示样品的 95％测量范围。 7.双波长评价 双波长测试过程中，由于标本中干扰组份的存在以及小孔杯本身质量等原 因，常常导致测定结果的假性增高，而酶标仪提供的双波长测定功能则可以消除 干扰组份或因素对测定结果的影响。在选择参比波长时，应对干扰组份的光谱进 行研究，以正确选择参比波长；而对于小孔杯本身质量问题等干扰因素的消除， 只要选择远离测定波长的参比波长即可以了。这对保证测定结果的准确性是非常 重要的。 评价方法：取同一厂、同一批号酶标板条（每个通道 2 条共 24 孔）每孔加 入 200µl 甲基橙溶液（吸光度调至 0.065～0.070 A）先后于 8 个通道分别采用单 波长（490 nm）和双波长（测定波长 490 nm、参比波长 630／ 650 nm）进行检 测，计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度，比较各组之间是否具有统计 学差异以考察双波长清除干扰因素的效果。 数据记录及处理 表 16-1 滤光片波长精度检查（单位：nm） 标定值 检测值 差值 结论 表 16-2 灵敏度和准确度的监测 灵敏度 准确度

「第一次 第二次 第三次 均值 结论 表16-3通道差检测 迪道号1 2 3 浓度1 浓度1 浓度 浓度2 浓度2 浓度2 浓度3 浓度3 浓度3 极差 结论 表16-4孔间差检测（记录各孔吸光度值） A B 9 10 12 结论： 表165零点飘移 时间点 30s 60s

第一次 第二次 第三次 均值 结论 表 16-3 通道差检测 通道号 1 2 3 4 5 6 7 8 浓度 1 浓度 1 浓度 1 浓度 2 浓度 2 浓度 2 浓度 3 浓度 3 浓度 3 极差 结论 表 16-4 孔间差检测（记录各孔吸光度值） A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 结论： 表 16-5 零点飘移 通道号 时间点 1 2 3 4 5 6 7 8 30s 60s

90s 120 150s 180s 210 240 结论： 表166精密度评价 1 浓 浓 2 3 13 1 浓度 3 批内精密度= 日内批间精密度三 日间精密度三 总精密皮三 CV值= 结论： 表16-7线性测定 2 3 8 浓度1 浓度2 浓度 浓度4 浓度5 回归方程： 相关系数r 标准估计误差Sy,x: 样品的95%测量范围

90s 120s 150s 180s 210s 240s 结论： 表 16-6 精密度评价 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 浓 度 1 浓 度 2 浓 度 3 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 浓 度 1 浓 度 2 浓 度 3 批内精密度＝ 日内批间精密度＝ 日间精密度＝ 总精密度＝ CV 值＝ 结论： 表 16-7 线性测定 1 2 3 4 5 6 7 8 浓度 1 浓度 2 浓度 3 浓度 4 浓度 5 回归方程： 相关系数 r： 标准估计误差 Sy,x： 样品的 95％测量范围：

结论： 表16-8双波长评价 单波长(490nm) 孔号123 4 5 6 8 9101112 通道1 通道2 通道3 通道4 通道5 酒道6 通道7 通道8 孔号 131415 1617 18 19 20 21 23 24 通道1 通道2 通道3 通道4 通道5 通道6 通道7 通道8 双波长（90/50n 孔号 12345 6 7 8 9 10 1112 通道1 描道2 通道3 通道4 通道5 通道6 通道7 通道8 孔号 131415 1617 18 9 23 24 通道1 通道2 通道3 逝道4 通逍5 通道6 通道7 通道8 计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度，比较各组之间是否具有统计 学差异以考察双波长清除干扰因素的效果

结论： 表 16-8 双波长评价 单波长（490 nm） 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 通道 1 通道 2 通道 3 通道 4 通道 5 通道 6 通道 7 通道 8 孔号 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 通道 1 通道 2 通道 3 通道 4 通道 5 通道 6 通道 7 通道 8 双波长（490/650 nm） 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 通道 1 通道 2 通道 3 通道 4 通道 5 通道 6 通道 7 通道 8 孔号 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 通道 1 通道 2 通道 3 通道 4 通道 5 通道 6 通道 7 通道 8 计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度，比较各组之间是否具有统计 学差异以考察双波长清除干扰因素的效果

结论： 注意事项 1.酶标仪为贵重仪器，使用过程中要小心操作。必须在老师指导下完成实验。 2.测定探头不能沾上液体，如不慎沾上液体，应用擦镜纸小心擦拭干净。 3.酶标仪在运行过程中运行轨道上不得有障碍物，更不得以外力强行停止酶 标板的运动。 思考题 1.简述酶标仪的工作原理。 2.酶标仪的性能评价指标有哪些？如何测试？ 3.ELISA试验的影响因素有哪些？怎样克服？

结论： 注意事项 1.酶标仪为贵重仪器，使用过程中要小心操作。必须在老师指导下完成实验。 2.测定探头不能沾上液体，如不慎沾上液体，应用擦镜纸小心擦拭干净。 3.酶标仪在运行过程中运行轨道上不得有障碍物，更不得以外力强行停止酶 标板的运动。 思考题 1. 简述酶标仪的工作原理。 2. 酶标仪的性能评价指标有哪些？如何测试？ 3. ELISA 试验的影响因素有哪些？怎样克服？