《生物化学实验》课程教学资源（讲义）层析（补充页）

补充页: ※接54页最后一行: 根据上述假设导出的平衡塔板理论,初步阐明了溶质的分布随柱内流动相 体积的变化规律,导出了层析洗脱曲线方程(曲线方程从略)。它形象定量地描 述了层析柱的柱效率等,初步揭示了层析分离的真实过程。对层析技术的发展 起了重要的推动作用。但是由于平衡塔板理论采用的是平衡过程的研究方法, 忽略了许多动力学因素对柱分离效率的影响,如分子的扩散及运动速度等。因 此这是一个半经验性理论。实际上,层析分离与分子的扩散及运动速度是有关 的,而且,同一溶质在不同流动相流速下将具有不同的理论塔板数,所以,后 来又发展了非平衡态的层析理论,或称速率理论。该理论对层析的平衡塔板模 型作了修正,提出了连续流塔板模型,并也导出了层析洗脱曲线方程(曲线方 程从略),两个洗脱曲线方程是非常相似的,不过,在速率理论中的塔板高度已 不象平衡塔板理论中具有十分明确的物理意义,它考虑了分子的扩散运动,得 到的理论塔板当量高度H仅仅是衡量柱分离效率的一个参数值了 ※接56页倒数第2行 分辨率也可采用基本分离方程来表示 R= 式中:N:理论塔板数, D2:组分2在固定相与流动相中的质量分布比,也称容量因子 α:分离因子,也称选择性因子 固定相中溶质量固定相中浓度固定相体积 流动相中溶质量流动相中浓度流动相体积 D=K×Vs/Vm(Vs一固定相体积,Vm一流动相体积) a=D2/D1,一般也可以认为与两组分的分配系数有关。当两组分的分配 系数相差较大时,(D2>D1),α变大,Rs增大,有比较好的分离效果。 从上式看到,N、a、D直接与Rs有关,即直接影响分离的效率,改变这 些条件可以提高分辨率。下面我们将分别加以简要的讨论与说明,以指导我们 选择最佳条件,达到更好的分离效果 由上式可以看出,当D2→0和a→1时,Rs→0,分辨率变得极低,但D2 值太大时则分离时间太长,不同类型的层析情况不同,用凝胶过滤层析时,分 配系数K值最大为1,则D值不可能不大;而在离子交换层析中,D值可以很 大。当α接近1时,不管怎样加大α值和使D值最适化,都不能达到分离的目 的,必须改变条件,加大α值。在不同类型的层析法中,用不同的办法改变a 值:如在分配层析中,改变流动相和固定相的组成以改变其极性大小;在离子 交换层析中,可以选择不同的离子交换剂,或改变流动相的pH值和离子强度; 在凝胶过滤层析中,则选用不同孔径的凝胶介质

补充页： ※ 接 54 页最后一行： 根据上述假设导出的平衡塔板理论，初步阐明了溶质的分布随柱内流动相 体积的变化规律，导出了层析洗脱曲线方程（曲线方程从略）。它形象定量地描 述了层析柱的柱效率等，初步揭示了层析分离的真实过程。对层析技术的发展 起了重要的推动作用。但是由于平衡塔板理论采用的是平衡过程的研究方法， 忽略了许多动力学因素对柱分离效率的影响，如分子的扩散及运动速度等。因 此这是一个半经验性理论。实际上，层析分离与分子的扩散及运动速度是有关 的，而且，同一溶质在不同流动相流速下将具有不同的理论塔板数，所以，后 来又发展了非平衡态的层析理论，或称速率理论。该理论对层析的平衡塔板模 型作了修正，提出了连续流塔板模型，并也导出了层析洗脱曲线方程（曲线方 程从略），两个洗脱曲线方程是非常相似的，不过，在速率理论中的塔板高度已 不象平衡塔板理论中具有十分明确的物理意义，它考虑了分子的扩散运动，得 到的理论塔板当量高度 H 仅仅是衡量柱分离效率的一个参数值了。 ※ 接 56 页倒数第 2 行： 分辨率也可采用基本分离方程来表示： Rs= N 4 · a a − 1 · 2 1 2 D + D 式中： N: 理论塔板数。 D2: 组分 2 在固定相与流动相中的质量分布比，也称容量因子。 : 分离因子，也称选择性因子。 D＝ 流动相体积 固定相体积 流动相中浓度 固定相中浓度 ＝ 流动相中溶质量 固定相中溶质量  ∴ D＝K×VS／Vm （VS—固定相体积 ，Vm—流动相体积）  = D2 / D1，一般也可以认为与两组分的分配系数有关。当两组分的分配 系数相差较大时，（D2D1）， 变大，Rs 增大，有比较好的分离效果。 从上式看到，N、、D 直接与 Rs 有关，即直接影响分离的效率，改变这 些条件可以提高分辨率。下面我们将分别加以简要的讨论与说明，以指导我们 选择最佳条件，达到更好的分离效果。 由上式可以看出，当 D2→0 和α→1 时，Rs→0，分辨率变得极低，但 D2 值太大时则分离时间太长，不同类型的层析情况不同，用凝胶过滤层析时，分 配系数 K 值最大为 1，则 D 值不可能不大；而在离子交换层析中，D 值可以很 大。当α接近 1 时，不管怎样加大α值和使 D 值最适化，都不能达到分离的目 的，必须改变条件，加大α值。在不同类型的层析法中，用不同的办法改变α 值：如在分配层析中，改变流动相和固定相的组成以改变其极性大小；在离子 交换层析中，可以选择不同的离子交换剂，或改变流动相的 pH 值和离子强度； 在凝胶过滤层析中，则选用不同孔径的凝胶介质

层析分离的最适化可图示如下: 原始分离 加大 加大N 减小D 增大D a.分离不良,两峰相距太近,应加大a值 b.加大α值后提高了分辨率,使两峰分开。 c.在a的基础上加大N,提高了柱效率,使峰变窄,但峰顶位置不变 d.减小D值,使峰提前岀现,节省了时间,但分辨率可能下降。增大D值,出峰延迟, 分辨率提高 改正:第180页倒数第1行中的“ Busche”应为“ Biochem

层析分离的最适化可图示如下： 原始分离 a t 加大α b t 加大 N c t 减小 D 增大 D d t a. 分离不良，两峰相距太近，应加大α值。 b. 加大α值后提高了分辨率，使两峰分开。 c. 在 a.的基础上加大 N，提高了柱效率，使峰变窄，但峰顶位置不变。 d. 减小 D 值，使峰提前出现，节省了时间，但分辨率可能下降。增大 D 值，出峰延迟， 分辨率提高。 改正： 第 180 页倒数第 1 行中的 “ Bischem ” 应为 “ Biochem ”