武汉大学：《分子遗传学与现代遗传学》课程教学资源（高等遗传学，研究生）第4讲 表观遗传学（3/3）表观基因组研究方法

武汉大学5表观基因组研究方法WuhanUnive一、全基因组甲基化测序二、甲基化DNA免疫共沉淀测序三、染色质免疫共沉淀测序Laboratory of plant molecular cytogenetics

Laboratory of plant molecular cytogenetics 5、表观基因组研究方法 一、全基因组甲基化测序 二、甲基化DNA免疫共沉淀测序 三、染色质免疫共沉淀测序

武汉大学全基因组甲基化测序Wuhan Universi研究目的与内容：1、构建全基因组甲基化图谱（DNAmethylationprofiling），全面而精确了解全基因组DNA甲基化状态及其高低甲基化位点在基因组不同区域的分布情况。2、多样品间差异性甲基化区域分析全基因组Bisulfite测序（WholeGenomeBisulfiteSequencing，WGBSBisulfite-Seg）：Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的C碱基区分开来，是表观遗传学研究的经典方法。将重亚硫酸盐处理方法和高通量测序（例如IlluminaHiSeq）技术结合，能够绘制出单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型的关联；也是研究表观遗传调控的机制的基础Laboratoryofplantmolecular cytogenetics

Laboratory of plant molecular cytogenetics 一、全基因组甲基化测序 研究目的与内容： 1、构建全基因组甲基化图谱（DNA methylation profiling），全面而精确了 解全基因组DNA甲基化状态及其高低甲基化位点在基因组不同区域的分布情况。 2、多样品间差异性甲基化区域分析 全基因组Bisulfite测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS； Bisulfite-Seq ）： Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的 C碱基区分开来，是表观遗传学研究的经典方法。将重亚硫酸盐处理方法和高通量 测序（例如 Illumina HiSeq）技术结合，能够绘制出单碱基分辨率的DNA甲基化图 谱，可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型的关联；也是研究表观遗传 调控的机制的基础

武汉大学Wuhan University全基因组甲基化测序实验技术路线基因组DNA全基因组DNA甲基化文库（DNA片段化末端修复、加A连接接头）Bisulfite处理PCR扩增lluminaHiSeg测序数据整体质量评估参考序列比对MC位点覆盖度统计甲基化位点检测A2X比对率统计甲基化水平统计差异甲基化分析A几八测序深度统计DMR相关功能注释全基因组甲基化水平统计八八DMR相关基因富集分析染色体水平甲基化密度分布A不同基因功能元件甲基化分布统计ACpG,CHG,CHH甲基化比例Laboratoryofplantmolecular cytogenetics

Laboratory of plant molecular cytogenetics 基因组DNA  全基因组DNA甲基化文库（DNA片段化末端修复、加A连接 接头 ）Bisulfite处理PCR扩增 Illumina HiSeq测序数据整体质量评估  参考序列比对   C位点覆盖度统计 甲基化位点检测    比对率统计 差异甲基化分析 甲基化水平统计    测序深度统计 DMR相关功能注释 全基因组甲基化水平统计   DMR相关基因富集分析 染色体水平甲基化密度分布  不同基因功能元件甲基化分布统计  CpG,CHG,CHH甲基化比例 全基因组甲基化测序实验技术路线

武汉大学DNANEBNextP5PrimerAdaptorUracilP7PrimerWuhan UniversityBarcode (BC)USEREnzymePCREnrichmentBC P7Fragmented DNA Input535'653433'55P7BCEnd Repair,5-Phosphorylation and dA-Tailing353inn535'35mi5in3'5P53P5A3A甲基化修饰接头A3A+亚硫酸盐处理：2i0UUUUoininm1noUUUUClean UpLaboratory of plant molecular cytogenetics

Laboratory of plant molecular cytogenetics 甲基化修饰接头 A A A A U U U U U U U U 亚硫酸盐处理

武汉大学Wuhan University测序样品要求：样品纯度：0D260/280值在1.8-~2.0之间：RNA应去除干净样品浓度：最低浓度不低于50ng/ul样品总量：每个样品总量不少于15ng样品溶剂：应溶解在H,0或TE（pH8.0）中样品运输：DNA低温运输（-20℃）；用parafilm将管口密封好，以防出现污染测序数据质量控制：包括reads数、总base数，Q2o比例Q20位点分布图、碱基分布图测序数据预处理：包括去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除：去除3”端质量Q低于20的碱基；去除reads中所有的接头序列；去除长度小于20的测序片段(reads)Laboratory of plant molecular cytogenetics

Laboratory of plant molecular cytogenetics 测序数据质量控制：包括reads数、总base数，Q20比例、 Q20位点分布图、碱基分布图 测序数据预处理：包括去除总体质量偏低的reads，将质量大于 20碱基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端质量Q低于20的 碱基；去除reads中所有的接头序列；去除长度小于20的测序片 段（reads） 测序样品要求： 样品纯度：OD 260/280值 在1.8 ～ 2.0之间；RNA应去除干净 样品浓度：最低浓度不低于50ng/ul 样品总量：每个样品总量不少于15ng 样品溶剂：应溶解在H2O或TE（pH8.0）中 样品运输：DNA低温运输（-20℃）； 用parafilm将管口密封好，以防出现污染

武汉大学WuhanUniversityOCpG岛区域、启动子区域及整个基因组的覆盖及不同深度关系25-4950-99519-24≥1001583NocoverageNocoverage≥100-19-1-4-10-24-5-9-25-49≥100710-24~50-9925-4950-99NocoveragepromoterwholegenomeCpGislandLaboratoryofplant molecular cytogenetics

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武汉大学OCPG/CHG/CHH位点漫盖率、测序深度、甲基化比例和染色体分布Wuhan Univ【2】CpG/CHG/CHH位点甲基化比例【1】CpG/CHG/CHH位点测序深度2005-methylationpercentagesite depthdistribution90+8g20+90oranaRouanai90+090+00'990+0200+0000+90'0?30500102040608010002040reads number【4】高甲基化位点（甲基化比例>70%）和低甲基化位点【3】CpG/CHG/CHH位点染色体分布（甲基化比例<30%）的基因功能区分布chromosomedistribution【5】申基化程度（%）对于基因的不同功能区域的分布25000002000000aH1mCHH/CHH-H1mCHG/CHGH1mCG/CG1001500000eeon8060100000040500000203'UTRIntronPromoter5'UTRExon234567890123456789X卡#####号Laboratory of pla

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武汉大学O差异甲基化位点或区段的CpG岛注释和基因注释0全基因组甲基化图谱[1]差异甲基化位点或区段CpG岛分布【2】差异甲基化位点或区段不同基因功能元件分布ChromosomeGraphCpG content and neighborhood contextPieChartofgenericfeaturesBTUTRHypermethylation Hypomethylation Centromere5.94%(1352)38.87%(8040)Island5.83%(1327)Shore口Lhwwhiachr124.97%(5682)国Others2.68%(609).1-chr2-chr3-141chr4a-chr5营37.27%(7710)39.23%(8927)chr621.35%(4857)23.86%(4935)0chr7ochr8-【3】差异甲基化位点或区段染色体分布ai-chr9chr10+ganwauChromosomelocation-chr11HW/ai5 y1 2s+chr12+chv6: 2211Hw2175schr.13-chr7: 1495+chr14dhrd:1006waw*ehe1:-2604+chr15ch9: 487-4eEiges4 chY::23chr 16chr10: :1315-chr17chrX:2131ov1:-1314中chr18oh22:575ch12: 18046chr21:261Aaeuechr19achr13; 662cr20663chr14:721二ahr19:2043chrXchr15;726-18278chrt6:1107eh17:1903wwchrYchr21-Ichr11chr18--dr22che2ehr7ehr17-"h14chr15-ehrschr10aLaboratory of plant molecular cytogenetics

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武汉大学Wuhan University甲基化DNA免疫共沉淀测序二、CancerMatchNormalMeDIP-Seq (Methylated DNACellsBlood CellsImmunoprecipitationSequencing）测序是基于抗体富集原理进行测序的全DNAExtractionSonication基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5“-甲基5mC5mC胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生MeDIP甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。High-throughputSequencing利用MeDIP-Seq技术可以快速有效地寻找基因组上的甲基化区域，从Analysis而比较不同细胞、组织或疾病样本间oNormal的DNA甲基化修饰模式的差异CancerAGenomePositionLaboratory of plant molecular cytogenetics

Laboratory of plant molecular cytogenetics 二、甲基化DNA免疫共沉淀测序 MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）测 序是基于抗体富集原理进行测序的全 基因组甲基化检测技术，采用甲基化 DNA免疫共沉淀技术，通过5‘-甲基 胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生 甲基化的DNA片段，然后通过高通量 测序可以在全基因组水平上进行高精 度的CpG密集的高甲基化区域研究。 利用MeDIP-Seq技术可以快速有 效地寻找基因组上的甲基化区域，从 而比较不同细胞、组织或疾病样本间 的DNA甲基化修饰模式的差异

武汉大学Wuhan University技术路线：aRSamplequalificationTA超游波打断样品质检SampleaualificationRepairendsand add sequencing adaptor未端修复，加测序接头变性MBD甲基化DNA富集加入5-mc价体DNA成筹增DNAamplificationinclusterMeDIP集片股和高通最DNA测序DNA sequencingPCRamplification序所将100bp减50bpReadsSizeselection(200-300bp)测序北对至基国组★Librarytest(TAcione,Angilent2100)计序得到的peakQ-PCRqualification定位甲基化位点ClusterprepareandsequencingLaboratory of plant molecular cytogenetics

Laboratory of plant molecular cytogenetics 优势： 精确度高：基因组位点定位精确 性可达± 50bp。 可靠性高：直接对甲基化片段进 行测序和定量，无交叉反应 和背景噪音。 检测范围广：全基因组范围内甲 基化区域研究。 高性价比：经抗体富集高甲基化 区域进行测序，有效降低 测序费用 技术路线：